| 研究課題/領域番号 |
07459010
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| 研究機関 | 北陸先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
民谷 栄一 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 教授 (60179893)
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| 研究分担者 |
阪口 利文 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助手 (10272999)
村上 裕二 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助手 (70272995)
横山 憲二 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助教授 (80242121)
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| キーワード | 酸化還元酵素 / 低温微生物 / 電子メディエーター / グルタミン酸デヒドロゲナーゼ / バイオセンサー |
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| 研究概要 |
低温細菌の有する低温活性酵素は、最適温度域がより低温側に移行しており、活性化エネルギーも小さく、その機能や構造に興味が持たれている。しかしながら、低温活性酵素の研究は十分に行なわれておらず、特に、酸化還元酵素についての報告は殆どなく、低温活性の構造と機能の相関については明らかになっていない。そこで本研究では、新たに低温活性酸化還元酵素を捜索した結果、新規のアクセプター型のL-グルタミン酸デヒドロゲナーゼが得られたため、バイオセンサーへの応用をめざした基礎特性について検討した。
寒冷生物であるサケ・カニの内臓から肉汁寒天培地・10℃で低温細菌を単離した。この低温細菌の中で、最もL-グルタミン酸酸化活性の高いL101菌株を選択した。この菌株は、15℃で最適増殖を示す低温殺菌であり、グラム陰性・桿菌・極鞭毛を持ち、シトクロムcオキシダーゼ・カタラーゼ・菌体外プロテアーゼなどを持ちAeromonas属に属する細菌であることがわかった。L101菌株は、陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Sepharose,pH7.0)にて分離される2種類のアイソゾイムが存在した。2つのアオソザイムのうち、陰イオン交換クロマトグラフィーから低塩濃度で溶出される酵素をさらに、硫安塩析・ゲル濾過クロマトグライ-・陰イオン交換クロマトグラフィー(Q-Sepharose)・疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを用いて精製を行った。精製した酵素は、NADやNADPや酵素と反応せず、酸化還元色素であるニトロブルーテトラゾリウムやシトクロムcを電子受容体とする新規のL-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GLDH)であった。また、その温度特性は常温酵素である牛肝臓由来のNAD依存性のGIDHと比較して、最適温度域が低温側にあり、5℃においても最大活性(50℃)の40%の活性を残存しており、活性化エネルギーもほぼ半分の値を示した。さらに、フェロセン誘導体を電子メディエータとして、サイクリックボルタンメトリーにより酵素のキャタリティック電流も確認できた。
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