生物発光による遺伝子発現リアルタイム測定に基づく環境応答遺伝子のスクリーニング法

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07554045
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 近藤 孝男 名古屋大学, 大学院理学研究科, 教授 (10124223)
• 研究分担者: 石野 良純 宝酒造株式会社, 中央研究所, 主任研究員 ; 加藤 明 農水省北海道農業試験場, 作物開発部, 研究室長 ; 石浦 正寛 名古屋大学, 大学院理学研究科, 助教授 (20132730)
• キーワード: 生物時計 / 時計遺伝子 / シアノバクテリア / サーカディアンリズム / ルシフェラーゼ / 生物発光 / 突然変異 / 環境応答

研究概要

我々が開発した遺伝子発現のレポーターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の可能性や冷却CCDカメラによるスクリーニング技術を、多彩な生命現象に適用するための本研究を行った。すでに得られているシアノバクテリアのluxABをもったプモーターのライブラリはその挿入遺伝子断片が長く、以後の解析が困難であったので、PCR法が可能な600塩基対の断片をもった発光ライブラリーを作成した。このライブラリーはゲノムを5回以上含む、高品質のものであった。このライブラリーを使い、約10万クローンの形質転回転換体をスクリーニングし、約800の十分発光強度の高いクローンを選別した。これらのクローンは皆24次間周期の発光リズムを示し、以前報告した生物時計の広範な制御を確認した。
次にこの選別されたクローンに高温処理、低温処理、光強度変化、紫外線照射を行ない、発現の変化を調査した。大多数のクローンは同様な変動を示すが、いくつかの例外的な変動を示すクローンを見いだした。今後、発現の変化するクローンの詳細な検討を行い、興味のある変動をしめすクローンを解析する予定である。
一方、生物時計に強く制御されると思われる多数のクローンから10個を選び、その挿入配列を決定し、既に全ゲノム配列の決定されている近縁のSynechocystisのデーターベースから相同遺伝子を探索したところ、6つの遺伝子を同定することが出来た。今後これらの遺伝子の生物時計および環境応答における生理学的意味を解析する。さらにその相同遺伝子を高等植物で探索し、その発現の環境応答を調べれば、高等植物の環境による遺伝子発現制御を解明することが期待できる。
また米国との共同研究でカルシュウムにより発光するエクオリンの遺伝子をもつ、形質転換植物でカルシュウムが変動すること、光条件により大きくレベルが変化することを見いだした。

研究成果

• [文献書誌] Kondo,T.,et al,.: "Circadian rhythms in rapidly dividing cyanobacteria." Science. 275. 224-227 (1997)
• [文献書誌] Liu,Y.,et al.: "Circadian expression of genes involved in the purine biosynthetic pathway of cyanobacterium Synechococcus sp.strain PCC7942." Mol.Icrobiol.20. 1071-1081 (1996)
• [文献書誌] Tsinoremas,N.F.,et al.: "A sigma factor that modifies the circadian expression of a subset of genes in cyanobacteria." EMBO J.15. 2488-2495 (1996)
• [文献書誌] Liu,Y.,et al.: "Bacterial luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria" J.Bacteriol.177. 2080-2086 (1995)
• [文献書誌] Liu,Y.,et al.: "Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria." Genes and Development. 9. 1469-1478 (1995)
• [文献書誌] Johson,C.H.,et al.: "Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants." Science. 269. 1883-1887 (1995)