海洋性超好熱細菌からのスーパー酵素の開発・利用に関する研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07556048
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 左子 芳彦 京都大学, 農学研究科, 助教授 (60153970)
• 研究分担者: 丸山 正 (株)海洋バイオテクノロジー研究所, 主任研究員 ; 石野 良純 京都大学, 生物分子工学研究所, 主任研究員 ; 内田 有恆 京都大学, 農学研究科, 教授 (50027190)
• キーワード: 超好熱細菌 / 古細菌 / 海底熱水口 / 耐熱酵素 / 炭酸固定酵素 / CO_2固定 / プロテアーゼ

研究概要

海底熱水口に生息する超好熱細菌を分離して、遺伝子工学、分子医学、食品や化学工業に利用可能な耐熱及び耐薬剤性酵素の検索、精製およびその遺伝子クローニングを行い、未知遺伝子資源の開発・利用を目的として研究を行ってきた。
(1)長崎県橘湾の海底熱水口より分離した 適増殖温度80℃の新種の海洋性超好熱真正細菌Rhodothermusobamensisから、炭酸(CO_2)固定酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)を大量培養した細胞より精製したところ、分子量約100kDaのサブユニットから成る400kDaのホモテトラマ-であった。本酵素の 適反応温度は75℃で、多様な代謝産物により活性制御を受けるアロステリック酵素であり、強い耐熱性を有していた(90℃のhaif-life 4h)。この耐熱性は、基質やアロステリックエフェクター等の外因性因子によりさらに増強された。本酵素の遺伝子クローニングを行い、大腸菌で大量発現に成功した酵素は、野生株のそれとよく似た性質を有していた。
(2)トカラ列島小宝島の海岸硫気口より分離された 適増殖温度90〜95℃の新規超好熱古細菌Aeropyrumpernixより、菌体外プロテアーゼを精製した。本酵素は金属プロテアーゼであり、分子量約59kDaで、 適増殖温度100℃、125℃でのhaif-lifeが1.2時間という極めて高い耐熱性を有していた。また蛋白質変性剤にも耐性を有し、2%SDSにより活性が約2.6倍に上昇した。

研究成果

• [文献書誌] Y.Sako et al.: "Biochemical relationship of phosphenolpyruvate carboxylases(PEPCs) from thermophilic archaea" FEMS Microbiol.Lett.153. 159-165 (1997)
• [文献書誌] K.Tkai et al.: "Extremely thermostable phosphenolpyruvate carboxylase from an extreme thermophile,Rhodothermus obamensis" J.Biochem.122. 32-40 (1997)
• [文献書誌] K.Takai et al.: "Extrinsic thermostabilization factors and thermodenaturation mechanisms for phosphenolpyruvate carboxylases(PEPC) from extremely thermophilic bacterium" J.Fermen.Bioeng.84. 291-299 (1997)
• [文献書誌] Y.Sako et al.: "An extremely heat-stable extracellular proteinase(aeropyrolysin) from the hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix K1" FEBS Lett.415. 329-334 (1997)
• [文献書誌] K.Takai: "ppc,the gene for phosphenolpyruvate carboxylase thermophilic bacterium,Rhodothermus obamensis:cloning,sequencing and overexpression in Escherichia coli" Microbiology. (in press). (1998)
• [文献書誌] 野村紀通, 左子芳彦: "古風な新顔 : 海洋性超好熱古細菌Aeropyrum pernix" バイオサイエンスとインダストリー. 55・9. 27-28 (1997)