ニトリル代謝酵素遺伝子プロモーターを利用した新規高発現ベクターの開発と応用

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07556073
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小林 達彦 京都大学, 農学部, 講師 (70221976)
• 研究分担者: 片岡 道彦 京都大学, 農学部, 助手 (90252494) ; 清水 昌 京都大学, 農学部, 教授 (70093250)
• キーワード: ニトリル / プロモーター / アミド / イソバレロニトリル / 遺伝子

研究概要

放線菌Phodococcus rhodochrous J1の、(ニトリルをアミドへ変換する)のニトリルヒドラターゼ(L-NHase)のアミドによる誘導発現調節機構の解析を行った。その結果、L-NHase遺伝子(nhlBA)より上流部分を少なくとも約3.5kb含むクローンは全て(誘導物質である)アミドによりL-NHaseを誘導生成するのに対し、上流領域をさらに切り縮めたクローンはアミドの有無に関わらずL-HNaseが構成的に発現した。アミドによる誘導発現に関わる上流域には、二つのORF(nhlDとnhlC)が存在し、nhlCは正の、nhlDは負の調節遺伝子であった。また、nhlDが水銀、カドミウム、ひ素などの重金属を解毒あるいは細胞外へ排出する機能を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現調節に関わるタンパク質と相同性を示したのに対し、nhlCはnhhCや(Pseudomonas aeruginosaのアミダーゼの負の調節遺伝子である)amiCと相同性を示した。
一方、本菌のニトリラーゼのイソバレロニトリルによる誘導発現調節機構の解析を行った。その結果、ニトリラーゼ遺伝子(nitA)より1.4kb下流に存在する領域が、ニトリラーゼのイソバレロニトリルによる誘導発現に関わることが判明した。本領域には、一つのORF(nitR)が存在し、nitRから予想されるアミノ酸配列は、Pseudomonas putidaのキシレン代謝系遺伝子の誘導発現を正に調節するXylSおよび大腸菌のアラビノース代謝系遺伝子発現を調節するAraCと相同性を示した。また、プライマーエクステンション法により、nitAの転写開始点は開始コドンより26bp上流のCであることが明らかとなった。さらに、nitA上流域の種々デリーションクローンを作製し、nitAのプロモーターとして機能する領域を特定した。

研究成果

• [文献書誌] Komeda,H.,Kobayashi,M.& Shimizu,S: "A novel gene cluster including the Rhodococus rhodochrous J1 nhlBA genes encoding a low molecular mass nitrile hydratase (L-NHase) induced by its reaction product" J.Biol.Chem.271. 15796-15802 (1996)
• [文献書誌] Komeda,H.,Kobayashi,M.& Shimizu,S: "Characterization of the gene cluster of a high-molecular-mass nitrile hydratase (H-NHase) induced by its reaction product in Rhodococcus rhodochrous J1" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93. 4267-4272 (1996)
• [文献書誌] Komeda,H.,Hori,Y.,Kobayashi,M.& Shimizu,S.: "Transcriptional regulation of the Rhodococcus rhodochrous J1 nitA gene encoding a nitrilase" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93. 10572-10577 (1996)
• [文献書誌] Komeda,H.,Kobayashi,M.& Shimizu,S: "Hyperiinduction of nitrile hydratase acting on indole-3-acetonitrile in Agrobacterium tumefaciens" Appl.Microbiol.Biotechnol.45. 176-181 (1996)
• [文献書誌] Yamada,H.& Kobayashi,M.: "Nitrile hydratase and its application to indusuction Production of acrylamide" Biosci.Biotech.Biochem.60. 1391-1400 (1996)
• [文献書誌] Kawashima,H.,Kozuki,N.,Kobayashi,M.& Shimizu,S.: "Biosynthesis of trans fatty acids in a fungus,Cladosproium sphaerospermum,and some bacteria isolated from fish viscera" Biosci.Biotech.Biochem.60. 1888-1890 (1996)