| 研究課題/領域番号 |
07556092
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
和泉 好計 鳥取大学, 工学部, 教授 (40026555)
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| 研究分担者 |
古田 武 鳥取大学, 工学部, 教授 (10026164)
大城 隆 鳥取大学, 工学部, 助手 (00233106)
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| キーワード | Haloperoxidase / Algae / Halogenation |
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| 研究概要 |
本酵素のN末端アミノ酸配列の解析を常法に従って行ったが、シグナルが検出されなかったことよりN末端はブロックされているものと考えられた。内部ペプチドについてはトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、臭化シアンを用いた各切断法により多数の断片の配列を決定することができており、その中にはDNAプローブを合成する際に都合の良いアミノ酸配列も存在しているので、これらのアミノ酸配列の情報を基にDNAクローニングのためのオリゴヌクレオチドプローブを数種合成した。一方、一般的に海藻からのDNA抽出は海藻が多種多量の多糖類を含有しているため困難とされており、Corallina piluliferaの場合もDNA抽出は当初容易ではなかったが、種々の抽出法を検討した結果、液体窒素存在下で藻体を破砕後、多糖類と核酸の分離精製を容易にするソルビトールを高濃度に含むバッファーを用いることにより充分量のDNAを取得することができた。得られた染色体DNAを鋳型とし、上記プローブを用いてPCR反応を行ったところ、ブロモペルオキシダーゼをコードしていると考えられるDNA断片の増幅が確認された。このPCRで増幅されたDNA断片をプローブとしてC.piluliferaのDNAライブラリーから本酵素の遺伝子領域を含むDNA断片の取得を試み、2.5kbpのポジティブクローンを得た。現在この断片の縮小化を行っている。
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