| 研究課題/領域番号 |
07556092
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
和泉 好計 鳥取大学, 工学部, 教授 (40026555)
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| 研究分担者 |
古田 武 鳥取大学, 工学部, 教授 (10026164)
大城 隆 鳥取大学, 工学部, 助手 (00233106)
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| キーワード | Haloperoxidase / Algae / Halogenation / bpo遺伝子 |
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| 研究概要 |
今年度の研究実績は次の4つにまとめれられる.
(1)海藻ピリヒバ藻体からのRNAの抽出
我々はSuとGiborの方法を参考にし、高塩濃度のLiCl(3M)を用いたRNAや炭水化物の分別沈殿を基礎とする方法を用い,また、酸化したポリフェノールによるRNAの不活性化を防ぐための還元剤として2-メルカプトエタノールを用いた結果、凍結乾燥藻体10gから200μgのRNAの抽出に成功した。
(2)プラークハイブリダイゼーション
抽出したRNAからmRNAを精製しdscDNAの合成を行い、RIを用いてその合成を確認した。合成したdscDNAにEcoRIアダプターを付加し、λgt10/EcoRI/CIAP-prepared armsにライゲイトし、パッケイジングした。それをE.coliNM514に感染させたところプラークの形成が見られた。そこで前述のPCR産物をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行った。その結果陽性プラークが得られた。
(3)シークエンス
(2)のプラークよりcDNAを抽出し、それをpBlueScriptに導入し塩基配列を決定した。その結果、全長1797bpで599アミノ酸をコードするORFが見いだされ、内部アミノ酸配列の存在を認められた。さらに生成するタンパク質の分子量は66kDaと計算され、SDS-PAGEから算出されるブロモペルオキシダーゼのサブユニット分子量67kDaとほぼ一致することによりこのORFがブロモペルオキシダーゼをコードする遺伝子であると判断しbpoと称することにした。
(4)ブロモペルオキシダーゼ遺伝子(bpo)の発現
bpoを発現ベクターであるpKK223に挿入しE.coliJM109に導入した。これを一晩振とう培養し集菌後超音波破砕した。それをSDS-PAGEにより分析したが特徴的なバンドは確認されなかった。そこでcell-free extractを用いて活性測定を行った。その結果、NaVO3と酵素を3時間プレインキュベートして初めて活性が検出された。
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