レーザー誘導蛍光による定量的メッセンジャーRNA測定法の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07556115
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 酒井 仙吉 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (80114487)
• 研究分担者: 河本 馨 日本獣医畜産大学, 獣医学部, 客員教授 (30011894) ; 青木 不学 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (20175160)
• キーワード: コンペティティブRT-PCR / 蛍光標識プローブ / キャピラリー電気泳動 / カゼイン / カゼインmRNA / フローレスチン / 乳腺 / コンペティタ-DNA

研究概要

カゼインcDNAのクローン化とコンペティティブRT-PCRの確立:分子量2.2万のカゼインmRANから相補DNAをクローン化し、その塩基配列を決定した。乳腺組織に存在するカゼインmRNAを定量するため、コンペティティブRT-PCRを確立した。用いたコンペティタ-DNAは、相補DNAに外来遺伝子を導入して作成した。
動物実験条件の確立:泌乳中の乳腺においてカゼインmRNAは分娩後から増加し、泌乳最盛期で最大となった。その後徐々に減少した。泌乳を強制的に停止させるとカゼインmRNAは9時間後から急速に減少し、哺乳を再開させると増加した。カゼインmRNAが大きく変化する動物実験条件を明らかにした。
蛍光標識プローブの作成:フローレスチン標識ヌクレオチドを用いPCRにより、センスプライマーとアンチセンス-プライマーの作成を行った。しかし、標識度が低く実験用の標識プローブとして用いることが出来なかった。約400塩基のPCR断片をプラスミドに導入し、制限酵素(Spel 1)により切断後、標識ヌクレオチドの存在下でT7及びSP6ポリメラーゼを用いて標識したRNAプローブを作成した。
電気泳動によるRNAの分離:キャピラリー電気泳動装置を使用して泳動条件を検討した。標準物質としてフローレスチン標識ヌクレオチド及び合成した標識RNAプローブを用いた。フローレスチン標識ヌクレオチド10^<-15>モルの検出感度が得られた。また、合成した標識RNAプローブにおいては泳動パターンが鋭敏でなく目下検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Hondo,E.,Kurohmaru,M.ら: "Prolactin Receptor Expression in Rat Spermatogenic Cells" Biology of Reproduction. 52巻. 1284-1290 (1995)
• [文献書誌] Sakai,S.: "Processing of Prolactin by Mammary Cells of the Lactuting Mouse" Animal Science and Technology. 66・9. 810-812 (1995)
• [文献書誌] Sakai,S.: "Prolaction Causes the Dissociation of Prolaction from Plasme Membrane Receptor in lactating Mouse Mammary Cell" Endocrine Journal. 43・1. 93-100 (1996)
• [文献書誌] Mizoguchi,Y.,Kim,J.Y.ら: "Acute Expression of the Prolactin Receptor Gene after Ovariectomy in Midpregnent Mouse Mammary Gland" Endocrine Journal. 43・5. 537-544 (1996)
• [文献書誌] Mizoguchi,Y.,Kim,J.Y.ら: "The regulation of the Prolactin Receptor Gene Expression in the Mammary Gland of Early Pregnent Mouse" Endocrine Journal. 44・1(印刷中). (1997)