| 研究課題/領域番号 |
07556118
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
中里 幸和 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (60001525)
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| 研究分担者 |
遠藤 士郎 日本分光(株), 第一技術部, 係長
加藤 憲夫 農林水産省, 家畜衛生試験場・総合診断研究部, 室長
伊藤 茂男 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (40109509)
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| キーワード | ATP分泌 / カテコールアミン分泌 / 分離副腎髄質細胞 / 蛍発光酵素 / 電気化学検出器 / 蛍光測定 / ニュートラルレッド / SBFI |
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| 研究概要 |
(1)カテコールアミンとATPのオンラインによる測定法を詳細に検討した。カテコールアミンは引加電圧450mVの炭素電極を用いた電気化学検出器により測定し、ATPは光電子増倍管の入射面に設置した攪拌層内でにルシフェラーゼとルシフェリン混合液と混和し、発光させた。(2)50mg蛍尾抽出物からゲル濾過分離精製ルシフェラーゼに8μg/ml合成ルシフェリンを用いることにより10nMATPが測定できた。カテコールアミンとATPの同時適用により同じ時間経過の反応が光電子増倍管と電気化学検出器により記録された。(3)ブタ培養副腎髄質細胞をカバーグラスの上で培養し、これを0.5mlのチェンバーに入れ、2ml/分で細胞の表面潅流を行った。アセチルコリン、高濃度K及びBaを2分間適用すると、アセチルコリンと高濃度K反応は投与期間中に減少したが、Baの反応は持続した。いずれの刺激もカテコルアミンとATPを同じ時間経過で放出させ、カテコルアミン/ATP比は10:1から8:1であった。現在、副腎髄質血管潅流標本を用いて両者の同時放出を検討し始めている。(4)単一細胞の分泌反応を蛍光測定により検出可能か否かを調べる目的で、分離副腎髄質細胞をNaイオン蛍光指示薬であるSBFI-AMで処置し、色素の細胞内分布を調べた。パッチ電極で細胞膜を破壊し、可溶性SBFIを除去すると1/4が細胞内膜系に取り込まれていたが、残った蛍光は分泌顆粒ではなく主に核膜に存在するようであった。(5)分離髄質細胞をニュートラルレッドで処置すると赤色に染色されるが、この色素は主に分泌顆粒に分布していた。単一細胞に取り込まれたこの色素の蛍光を測定し、分泌刺激による色素の放出による蛍光量の減少が測定できるか否かを検討している。
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