In situ PCR法の開発とその組織化学染色法の確立

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557001
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 滋賀医科大学
• 研究代表者: 木村 宏 滋賀医科大学, 分子神経生物学研究センター, 教授 (40079736)
• 研究分担者: 遠山 育夫 滋賀医科大学, 分子神経生物学研究センター, 助教授 (20207533)
• キーワード: PCR法 / in situハイブリダイゼーション / 組織化学 / mRNA / 核酸 / 組織固定 / 画像解核 / 細胞

研究概要

生体の組織切片においてmRNAに特異的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を行い、高い特異性と感受性を有するmRNA染色法を開発し、さらに画像解析技術を適用して定量的測定を可能にするシステムを確立するのが本研究の目的である。具体的には、
1)組織切片上でmRNAからの逆転写によるcDNA生成法の開発、
2)各種の(ポリ)ペプチドをコードする特異的mRNAの鋳型作製
3)in situでのcDNAの増幅と産物の可視化
4)可視化された産物の形態学的定量、の4点が3年間の計画で達成すべき技術である。本年度の研究目的は、組織切片上における逆転写酵素反応の最適条件を確立することにあり、
1)逆転写酵素反応を至適条件で行うための最良の組織固定法の確立。
2)RNA変性の防止法
3)アンーリングおよび転写反応の温度設定と時間
4)適正な5'プライマーの決定、について実験研究を遂行した。この段階まではPCR法を使わなくともコピー数の多いmRNAの代表としてバゾプレッシンを選べば判定が可能であった。その結果、従来の報告では全く顧みられることのなかったオスミウム酸による組織固定が上記の1)と2)を同時に満足する可能性があることが見出された。この発見をもとに実験を重ねているが、オスミウム酸固定の理論的詳細が不明なため、考えられる種々の還元剤を組み合わせを検討中である。いずれにせよ、組織内細胞膜の脂質や蛋白質の固定とはかなり異なった化学反応が核酸分子との間に生じているものと想定され、その解析が重要であると考えられた。この組織固定法を用いた場合でも、3)および4)の条件は従来の方法でのそれが適用でき、染色標本を新しく作製したコンピュータプログラムによる画像解析が可能であった。

研究成果

• [文献書誌] Yasuhara O.et al.: "Pick's disease immunohistochemistry: new alterations and Alzheimer's disease comparisions." Acta Neuropathol.89. 322-330 (1995)
• [文献書誌] Nakayasu H.et al.: "Cerebral GABA_A and GABA_B receptors." Ann. NY Acad. Sci.757. 516-527 (1995)
• [文献書誌] Tooyama I,et al.: "Subcellular localization of low density lipoprotein receptor‐related protein(a2‐macroglubulin receptor)in human brain." Brain Res.691. 235-238 (1995)
• [文献書誌] Hamaguch A.et al.: "Demonstration of fibroblast growth factor receptor‐1 in human prostate by polymerase chain reaction and immunohistochemistry." Prostate. 27. 141-147 (1995)
• [文献書誌] Araki,M.et al.: "High potassium promotes differentiation of retinal neurons but does not favor and differentiation of rods." Brain Res.89. 103-114 (1995)
• [文献書誌] Matsuoka Y.et al.: "Neuroprotective effects of NBOX on hypoxia‐induced neuronal damage in rat hippocampus." Neuroreport. 6. 2205-2208 (1995)