新しい抗炎症薬開発を目指した脂肪酸シクロオキシゲナーゼ-2の測定キットの開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557014
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 山本 尚三 徳島大学, 医学部, 教授 (50025607)
• 研究分担者: 樋口 昭平 大正製薬, 開発研究所, 室長 ; 原田 芳照 北里大学, 医学部, 教授 (20050677) ; 田辺 忠 国立循環器病センター, 研究所, 部長 (60025624)
• キーワード: 抗炎症薬 / 炎症 / プロスタグランジン / シクロオキシゲナーゼ / アイソザイム / グルココルチコイド / ステロイド / 酵素阻害剤

研究概要

抗炎症薬、抗血小板凝集薬、抗アレルギー薬などの開発に際して、シクロオキシゲナーゼ(COX)という酵素は1つのマーカーとして扱われ、COXが阻害されるかどうかということが、研究開発の1つの示標であった。新しいアイソザイムのCOX-2の発見によって、検討すべきはCOX-2であると考えられるようになった。従来型のCOX-1と識別しつつ、種々の病態におけるCOX-2の動態を明らかにし、また、抗炎症薬の効果の1つとしてCOX-2の発現や活性に及ぼす影響を、的確に把握できるように、COX-2の活性・mRNA・蛋白量の測定方法を確立し、キット化して実用に供することを、本研究計画の目的として、以下の3つのアプローチを試みた。
1)特異的抗体の調製とその応用(山本・原田):COX-2特異的抗体はペプチド抗原を用いて既に私達は作っている。COX-1特異的なものは、以前にウシ精嚢腺やヒト血小板の酵素を抗原として作ったCOX-1モノクローン抗体を調べ直して、COX-2とは反対しないいくつかのクローンを得た。
2)mRNA定量法とその応用(田辺):ヒトのCOX-1とCOX-2のcDNAをプロープに使って、COX-1 mRNAに妨害されることなく特異的にCOX-2 mRNAをプロッティングできる条件を定めた。さらに、逆転写PCR法で感度よく簡便に測定しうる条件を検討し、蛍光標識による非放射性の方法を目指している。
3)炎症モデルの確立とその応用(原田・樋口):初年度はCOX-2誘導を伴うラットのカラゲニン胸膜炎を確立し、第二年度は無処理およびLPS処理のラットにアラキドン酸を静脈内投与し、血漿中プロスタノイドを測定して、それぞれCOX-1とCOX-2の生体内活性を決定する方法を検討した。

研究成果

• [文献書誌] N.Ueda: "Induction of cyclooxygenase-1 in a human megakaryoblastic cell line(CMK)differentiated by phorbol ester" Biochim.Biophys.Acta. 1344. 103-110 (1997)
• [文献書誌] W.Sakamoto: "Effect of vitamin E on expression of cyclooxygenase-2 in lipopolysaccharide-stimulated rat macrophages" Biochim.Biophys.Acta. 1304. 139-144 (1996)
• [文献書誌] Y.Harada: "Role of prostaglandin H synthase-2 in prostaglandin E_2 formation in rat carrageenin-induced pleurisy" Prostaglandins. 51. 19-33 (1996)
• [文献書誌] M.Ogino: "Increased migration of neutrophils to granulocyte-colony stimulating factor in rat carrageenin-induced pleurisy:Roles of complement,bradykinin,and inducible cyclooxygenase-2" Inflamm.Res.45. 335-346 (1996)
• [文献書誌] D.J.Kelley: "Benzo[a]pyrene up-regulates cyclooxygenase-2 gene expression in oral epithelial cells" Carcinogenensis. (in press). (1997)
• [文献書誌] J.R.Mestre: "Retinoids suppress phorbol ester-mediated induction of cyclooxygenase-2" Cancer Res.(in press). (1997)
• [文献書誌] 山本尚三: "ビタミン,70巻" 日本ビタミン学会, 453-463 (1996)
• [文献書誌] 鹿取 信: "日本血栓止血学会誌,7巻" 日本血栓止血学会, 60-63 (1996)