単一細胞における遺伝子発現の新しい解析法の開発と医学的応用

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557015
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 柴原 茂樹 東北大学, 医学部, 教授 (70206142)
• 研究分担者: 安元 研一 東北大学, 医学部, 助手 (90241629) ; 高橋 和広 東北大学, 医学部, 助手 (80241628) ; 柴田 孝史 ポーラ中央研究所, 皮膚科学研究部, 副主任研究員
• キーワード: 転写因子 / メラニン合成 / ヘム分解 / チロシナーゼ / ヘムオキシゲナーゼ / 細胞分化 / MITF

研究概要

細胞の分化・形態変化に伴う遺伝子発現の変化を単一細胞レベルで解析するために、ルシフェラーゼ発現細胞の半固定法と画像解析法を確立した。すなわち、ヒトチロシナーゼ遺伝子プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして持つ融合遺伝子を、MeWoヒトメラノーマ細胞で一時的に発現させ、同細胞を10%ホルマリンを含む生理食塩水で穏やかに固定した(4℃,30分)。このように半固定した細胞を、直ちに基質であるルシフェリン溶液(100μM)と反応させ(25℃,10〜30分)、細胞内の化学発光をフォトカウンテイングカメラにより解析した。その結果、半固定細胞内での発光を、二次元的に検出することに成功した。今後、確立したルシフェラーゼ発現細胞の画像解析法を利用することにより、細胞の形態を忠実に維持しながらレポーター遺伝子の発現を検出することが可能になった。
MITFが、ヒトチロシナーゼ遺伝子のメラノサイト特異的転写に関与するエンハンサー(TDE)に結合することを確認した。特に、TDEの中央に存在するCATGTGモチーフが、MITFの結合に重要であることが示唆された。さらに、MITFが、マウスチロシナーゼとTRP1遺伝子のプロモーター領域のCATGTGモチーフにも結合し、それぞれの遺伝子の転写を活性化することを明らかにした。
抗チロシナーゼモノクローナル抗体の作製に世界で初めて成功した。これまでに、多くの研究者が抗チロシナーゼモノクローナル抗体を作製しようと試みたが、未だに成功例はなかった。
一方、破骨細胞への機能分化を解析するための培養系として、ヒト前骨髄球性の急性白血病細胞株であるHL-60細胞を活性型ビタミンD_3で3日間処理し、多核の破骨細胞の形成の有無を解析した。しかし、多核の破骨細胞の形成を確認できなかった。さらに、培養条件を検討すると共に、別の培養細胞を試す必要がある。

研究成果

• [文献書誌] Okinaga S. et al.: "Regulation of human heme oxygenase-1 gene expression under thermal stress." Blood. (印刷中). (1996)
• [文献書誌] Fuse N. et al.: "Identification of a melanocyte-type promoter of the microphthalmia-associated transcription factor gene." Biochem. Biophys. Res. Commun.(印刷中). (1996)
• [文献書誌] Muraosa Y. et al.: "cDNA cloning of a novel protein with the two zinc-finger domains that may function as a transcription factor for the human heme oxygenase-1 gene." Eur. J. Biochem.235. 471-479 (1996)
• [文献書誌] Takimoto H. et al.: "MAT-1,a monoclonal antibody that specifically recognizes human tyrosinase." J. Invest. Dermatol.105. 764-768 (1995)
• [文献書誌] Yasumoto K. et al.: "Transcriptional activation of the melanocyte-specific genes by the human homolog of the mouse microphthalmia protein." J. Biochem.118. 874-881 (1995)
• [文献書誌] Abraham N. G. et al.: "Transfection of the human heme oxygenase gene into rabbit coronary microvessel endothelial cells:protective effect against heme and hemoglobin toxicity." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92. 6798-6802 (1995)
• [文献書誌] Suzuki H. et al.: "Evidence for the presence of two amino-terminal isoforms of neurofibromin, a gene product responsible for neurofibromatosis type 1." Tohoku J. Exp. Med.175. 225-233 (1995)
• [文献書誌] Takahashi K. et al.: "Reduced expression of neurofibromin in the soft tissue tumors obtained from patients with neurofibromatosis type 1." Clin. Sci.88. 581-585 (1995)
• [文献書誌] Takeda A. et al.: "Induction of heparin-binding growth-associated molecule(HB-GAM) in reactive astrocytes following hippocampal neuronal injury." Neuroscience. 68. 57-64 (1995)