| 研究分担者 |
高山 吉永 北里大学, 医学部, 助手 (90245407)
高垣 洋太郎 北里大学, 医学部, 教授 (50281324)
高田 史男 北里大学, 医学部, 助手 (90206764)
小口 弘毅 北里大学, 医学部, 講師 (30133292)
小林 邦彦 北海道大学, 医学部, 教授 (60091451)
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| 研究概要 |
1.P100血中濃度迅速測定系の開発
(1)リコンビナントP100蛋白の作製
前年度までに開発した,血中P100蛋白濃度測定系の感度と特異性を更に鋭敏にするために,抗P100ペプチド抗体に代わり,抗リコンビナントP100抗体を用いた測定系を開発する事とした.この為に,まずP100蛋白の重鎖と軽鎖をコードしているDNAをPCR法で増幅し,グルタチオントランスフェラーゼとの融合蛋白発現プラスミド内に組み換えて,グルタチオントランスフェラーゼ-P100融合蛋白を作製した.
(2)リコンビナントP100特異的抗体の作製
(1)で作製した融合P100蛋白を大腸菌内で大量調製後、P100蛋白の重鎖乃至軽鎖をそれぞれ精製した.今後,精製した組み換え重鎖乃至軽鎖をウサギに免疫してポリクローン抗体を,マウスに免疫してモノクローン抗体をそれぞれ作成し,次年度には様々な疾患の患者血清について測定を開始する計画である.
2.P100遺伝子迅速診断系の開発
(1)P100遺伝子構造解析
ヒトP100cDNAの塩基配列を参考にPCRプローブを設計し,ヒトゲノムDNAを鋳型にして直接P100のゲノム遺伝子をlong-PCR法により増幅し,解析した.その結果,ヒトP100遺伝子は16個のエクソン,15個のイントロンからなり,その全長は前年度のgenomic cloningで得た結果よりも長く,少なくとも70kb以上に渡って存在していることが新たに明らかとなった.
(2)P100遺伝子の多型検索及び解析
(1)のゲノム遺伝子解析によって,イントロン・エクソン結合部の塩基配列が明らかとなったので,各エクソンを個々にPCR増幅するためのイントロンプライマーを設計した.16個のエクソン各々はゲノムDNAを鋳型にしたPCRによって増幅・回収可能となった.現在、P100遺伝子多型を検索するために,健常児及び易感染性虚弱児の末梢血リンパ球より調整したゲノムDNAについて,PC-SSCP法の最適条件の設定を検討中である.
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