易感染性(虚弱)体質の迅速診断システムの開発

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557063
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 松浦 信夫 北里大学, 医学部, 教授 (50002332)
• 研究分担者: 高山 吉永 北里大学, 医学部, 助手 (90245407) ; 高垣 洋太郎 北里大学, 医学部, 教授 (50281324) ; 高田 史男 北里大学, 医学部, 助手 (90206764) ; 小口 弘毅 北里大学, 医学部, 講師 (30133292) ; 小林 邦彦 北海道大学, 医学部, 教授 (60091451)
• キーワード: 補体 / 虚弱体質 / 易感染性体質 / 補体活性化 / 遺伝子解析 / Mannan binding lectin(MBL) / Ra-reactive factor(RaRF) / 遺伝子診断

研究概要

1.P100血中濃度迅速測定系の開発
リコンビナントP100特異的抗体の作製-P100蛋白の重鎖乃軽鎖とグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合リコンビナント蛋白を大腸菌内で大量調整後、それぞれを精製した.このリコンビナント重鎖乃至軽鎖をウサギに免疫して抗リコンビナントP100抗体を作成し,その特異性と抗体活性を確認した.現在は前年度に作製した抗P100ペプチド抗体と今回新たに作製した抗リコンビナント抗体の両者を用いてサンドイッチ法による血中P100蛋白測定系の条件設定を検討しているところである.
2.P100遺伝子迅速診断系の開発
P100遺伝子の多型検索及び解析-正常ヒト末梢血リンパ球より調整したゲノムDNAを鋳型にして,P100を構成している16エクソンを個々にPCR増幅し,エクソンの塩基配列を直接決定した.この塩基配列をP100cDNAと比較したところ,5ヶ所のアミノ酸置換を伴う遺伝子多型が見つかった.その内の1つ,プロテアーゼ活性中心アミノ酸であるHisエクソンの近傍に存在する変異について特異的なプライマーを設計し,成人の末梢血リンパ球より得たヒトゲノムDNAを300例スクリーニングを行ってみた.解析の結果,上記領域内での遺伝子変異は現在のところ見つけられていない.しかしこれまでの検索対象は主に正常人と思われる集団に偏っていた.従って今後は,検索対象を正常人だけではなく易感染性虚弱児の末梢血リンパ球より調整したゲノムDNAに絞り込んだ解析,或いはまた残された他の4ヶ所の多型部位の存在を検索するが必要と考えられる.現在これらの変異検索のためのサンプルDNAの収集,調整を進行しているところである.また同時に,変異の存在しているエクソンについては,より安易かつ迅速に遺伝子変異の有無を検定可能にするために,PCR-SSCP法の条件設定を検討しているところである.

研究成果

• [文献書誌] Takada,F.et al.: "Localization of the genes for the 100-kDa complement-activating components of Ra-reactive factor(CRARF and Crarf)to human 3q27-q28 and mouse 16B2-B3." Genomics. 25. 757-759 (1995)
• [文献書誌] Ogata,R.T.et al.: "Substrate specificities of the protease of mouse serum Ra-reactive factor." Journal of Immunology. 154. 2351-2357 (1995)
• [文献書誌] 川上正也: "補体活性化レクチンRaRF-その分子構造から臨床まで-" 日本細菌学雑誌. 51. 717-736 (1996)
• [文献書誌] Nowatari,M.et al.: "Radioimmunoassay for the complement-activating component of Ra-reactive factor." Journal of Clinical Ligand Assay. (印刷中).