単一細胞のホルモン分泌を多次元的に検出する超高感度生物学的測定法の開発

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557070
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 清野 進 千葉大学, 医学部, 教授 (80236067)
• 研究分担者: 畔蒜 藤一 ヤマサ醤油(株), 研究開発本部, 主任 ; 稲垣 暢也 千葉大学, 医学部, 講師 (30241954)
• キーワード: ATP / インスリン / カルシウム / ATP受容体

研究概要

膵β細胞からインスリンとともにATPが放出されることを利用して、ATP受容体を高レベルで発現しているCPAE細胞と膵β細胞とを共培養し、グルコースや種々のアゴニスト刺激によるCPAE細胞内の[Ca^<2+>]iの変化をモニターすることにより、膵β細胞からのインスリン分泌を検出が可能であることを実証した。しかも刺激の種類により開口放出する部位が異なることが示唆され、空間的にも分泌をモニターすることが可能であることを示した。次にATPセンサーとなるATP受容体を同定するために、膵β細胞で発現する新たなATP受容体クローニングを試み、イオンチャネル型ATP受容体の新たなサブタイプであるP2X-4のレセプターを同定した。P2X-4は388個のアミノ酸から構成され、既報のP2X-1、P2X-2、P2X-3とはそれぞれ50%、49%と47%のアミノ酸の同一性が認められた。組織発現を検討したところ、このATP受容体は膵β細胞や内分泌細胞を含む種々の組織で広範囲に発現することが確認された。また、アフリカツメガエル卵母細胞の系でP2X-4を発現させ機能解析を行ったところ、ATP濃度依存性にC1^-電流が増強され、EC50値は63μMであった。ところが、ATPより惹起されたC1^-電流はATP受容体のブロッカーとされるsuraminやreactive-blueの処置では部分的にしか阻害されず、これまでに同定されているATP受容体とは薬理学的特性が全く異なることが明らかにされた。

研究成果

• [文献書誌] Ihara,Y.et al.: "Molecular diversity and functional characterization of voltage-dependent calcium channels(CACN4)expressed in pancreatic β-cells." Mol. Endocrimol.9. 121-130 (1995)
• [文献書誌] Oho,C.et al.: "Expression and complex formation of soluble N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein(SNAP)receptors in clonal rat endocrine cells." 186. 1995. (208-210)
• [文献書誌] Inagaki,N.et al.: "Cloning and functional characterization of a novel ATP-sensitive potassium channel ubiquitously expressed in rat tissues, including pancreatic islets, pituitary, skeletal muscle, and heart." J. Biol. Chem.270. 5691-5694 (1995)
• [文献書誌] Inagaki,N.et al.: "Expression and role of ionotropic glutamate receptors in pancreatic islet cells." FASEB. J.9. 686-691 (1995)
• [文献書誌] Yamada,Y.et al.: "The structures of the human calcium channel al subunit(CACNL1A2)and b subunit(CACNLB3)genes." Genomics. 27. 312-319 (1995)
• [文献書誌] Kuromi,H.et al.: "A monitor of secretion from single pancreatic β-cells." Diabetes. 44. 1213-1217 (1995)
• [文献書誌] Inagaki,N.et al.: "DNAsequence, gene structure, and chromosomal localization of the human ATP-sensitive potassium channel, uKATP-1, Gene(KCNJ8)." Genomics. 30. 102-104 (1995)
• [文献書誌] Inagaki,N.et al.: "Reconstitution of I_<KATP>: An inward rectifier subunit plus the sulfonylurea receptor." Science. 270. 1166-1170 (1995)
• [文献書誌] Blondel,O.et al.: "Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, receptors,secretory granules and secretion in endocrine and neuroendocrine cells." Trends Neurosci. 18. 157-161 (1995)