| 研究課題/領域番号 |
07557078
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
服部 俊夫 京都大学, ウイルス研究所, 助教授 (30172935)
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| 研究分担者 |
嶋山 隆 日立化成工業株式会社, 筑波間電研究所, 研究員補
山田 亮 日立化成工業株式会社, 筑波間電研究所, 主任研究員
内山 卓 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (80151900)
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| キーワード | HIV / リボザイム / RNA |
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| 研究概要 |
HIVの感染を阻止できる可能性のあるリボザイム(Rz)として感染に関与するenvelope蛋白の、中和エピトープであるV3領域を標的としてを作製した。すべてRNAからなる天然型Rzの他に、DNA/RNAキメラ型Rzやチオリン酸化Rzを合成、精製した。本実験に使用したボザイムは蛍光色素でラベルされてトランスフェクタムにより細胞への導入し共焦点顕微鏡で確認した。チオ化Rzは、2時間後に、細胞内に検出され核への移行が認められました。野生型では6時間をピークに12時間に蛍光は退色していきますが、チオ化の場合は24時間まで、細胞内に蛍光の存在が認められました。切断実験に用いるRNAtranscript はpSVIIIenv3-2のV3loop region を増幅してアイソトープラベルRNAをtranscriptして用いた。V3loop RNATranscript のsizeは414baseでRzcleaved fragment は予想通りに236baseと178base に認められた。木ribozyme の細胞内での効果を見る為にCD4positive のTcell sup T1とgpl20expressing CHOWPcell のfusion assay系を用いました。本アッセイ系ではrodamine 類の赤い色素DiIでT4陽性のsupT1 を生細胞ラベルした。融合により、その細胞の色素がgp120発現細胞に注入されますので、混合培養後1時間して、蛍光顕微鏡下にて、融合細胞数を数えた。 Rz のEnv-T4fusion阻止効果は示したようなtime courseでassayした。6時間で約10%の融合抑制効果が見られ、12時間の時wild type Rzが一番高い効果の45%に達して72時間まで保った。チオ化 Rzの効果は迅速に上がって72時間で69.8%のピーク値に昇った。不活化のRzはアンチセンス効果で72時間で38%の融合阻止効果を示した。今後はRzのEnv蛋白の抑制機構を明らかにしたい。
また成果は特願平9-36084を申請中である。
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