| 研究課題/領域番号 |
07557092
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
桑野 良三 新潟大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (20111734)
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| 研究分担者 |
熊西 俊郎 新潟大学, 脳研究所, 教授 (40018601)
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| キーワード | 遺伝子 / リコンビナーゼ / Cre-lox / トランスジェニック / ネオマオシン耐性 / マウス / 神経成長円錐 |
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| 研究概要 |
Cre-loxのDNA配列特異的リコンビネーションを利用して、Cre、loxそれぞれの遺伝子を持つマウスの交配して生じる遺伝形質を解析するのが本研究の目的である。8年度はloxマウス用のターゲット遺伝子とCreマウス用のCre遺伝子を改良し、作製したプラスミドを培養細胞に導入して発現で検討した。
ターゲット遺伝子に細胞破壊用のジフテリアトキシンAフラグメント遺伝子(DT-A)を用いた。プロモーターのアストロサイト特異的遺伝子(S100)の5'上流1kbあるいはモロニ-白血病ウイルスLTRとDT-Aの間にloxで挟まれた転写終結シグナル(ストッパー)を挿入した。細胞破壊される効率を検定するために、予備実験としてDT-Aの変わりにレポーター遺伝子として大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)を用いた。ストッパーとして、最初、SV40ポリAシグナルを利用したが、モロニ-白血病ウイルスLTRに駆動される転写を止めることができなかったが、酵母由来のスペーサーDNAを挿入することでほぼ100%転写を止めることができた。
一方、Cre遺伝子の発現は、初代培養細胞系を使ってターゲット遺伝子とのコトランスフェクションによって検討した。上記のストッパーを5'端に挿入してプロモーター非依存性発現を抑える様にしたが、プロモーターが存在しなくてもCre遺伝子が発現し、ストッパーがはずれレポーター遺伝子のlacZ陽性細胞が観察された。特異的細胞破壊が本研究の中心課題であるため、現在Cre遺伝子の発現の制御に取り組んでいる。
神経の形態形成を詳細に観察するため、神経成長円錐に局在する蛋白を分離・精製し、それらのペプチド抗体を作製した。
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