脂質平面膜を用いた膜電位感受性色素の評価系の開発とその応用

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557143
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 桐野 豊 東京大学, 薬学部, 教授 (10012668)
• 研究分担者: 浜岡 勤 富士写真フィルム(株), 機器事業本部, 部長 ; 川原 茂敬 東京大学, 薬学部, 助手 (10204752)
• キーワード: 膜電位感受性色素 / 水平平面膜 / シングルホトダイオードカメラ / ナメクジ神経細胞

研究概要

1.水平平面膜による電位感受性色素の光学的性質の測定系の構築
(1)水平平面膜用チャンバーの改良:カメラへの入力を大きくするために平面膜の大きさを直径1.2mmにまで広げ、かつ安定な膜を形成することに成功した。(2)蛍光強度及び吸光度変化の両測定に対応できる系の構築:蛍光及び吸光度の測定にそれぞれ光源としてキセノンランプと直流安定化電源つきのタングステンランプを用い、低ノイズの測定が可能となった。(3)平面膜の安定性の検討:アゾレクチンで張った膜に電位差を与えた結果、最低でも±150mVの範囲で膜電位を変えても安定であることが解った。これは生体の膜電位を調べるには十分である。また、代表的な膜電位感受性色素Di-4-ANEPPS、RH155、RH482で染色した結果、染色後最低15分は安定であり充分な測定時間が得られることが解った。以上の如く直ちに実測を開始できる系が予定通り完成した。
2.生体膜への適用
水平平面膜装置で用いた膜電位感受性色素の1つDi-4-ANEPPSをナメクジ単離脳に適用し、多点測定における有効性を評価した。光量の低下を極力防ぐために倒立蛍光顕微鏡(IX-70:オリンパス社)を底面ポート仕様に改造し、フォトダイオードアレイ(HRデルタロン:富士写真フィルム社)を接続した。(1)染色条件の検討:色素濃度、温度、時間、およびプロテアーゼ処理の是非を検討した結果、0.04%、20℃、25分、酵素処理なしの条件が最適であった。(2)光学条件の検討:一般に膜電位感受性色素の電位感受性は励起波長依存性を持つ。染色した単離脳を用いて波長依存性を検討した。励起フィルターは530-550nmがSN比が最も良く測定できることが解った。(3)ナメクジ単離脳の膜電位振動の測定:以上の条件を用いてナメクジ嗅葉介在神経集団の同期的膜電位振動の挙動を解析したところ、部位依存的な2種類の振動と匂い刺激に対する応答の様子が明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Kazunori Anzai: "Rapid measurement of Internal Volumes of Membrane Vesicles with ESR-Stopped Flow Technique" Magn. Reson. Medicine. 6. 190-191 (1995)
• [文献書誌] Akihide Kusumoto: "Simultaneous Measurement of Changes in Intracellular Calcium Ions and Degranulation in Single Intact Mast Cells from Rat Peritoneum" Bioimages. 3. 1-5 (1995)
• [文献書誌] 桐野 豊: "生体内酸素濃度測定法の開発" 学術月報. 48. 81 (1995)
• [文献書誌] Hiroshi Tokumaru: "A Calcium Channel from the Presynaptic Nerve Terminal of the Narke japonica Electric Organ Contains a Non-N-type α_2δ Subunit" j. Neurochem.65. 831-836 (1995)
• [文献書誌] Kazunori Anzai: "Phosphatidylserine-specific Transbilayer Lipid. Translocation in Synaptosomal Plasma Membranes from Narke japonica" J. Biochem.117. 1232-1237 (1995)
• [文献書誌] Seiji Sakamoto: "Enhanced Membrane-Perturbing Activities of Bundled Amphiphilic α-Helix Polypeptides on Interaction with Phospholipid Bilayer" Bull. Chem. Soc. Japan. 68. 2931-2939 (1995)
• [文献書誌] 桐野 豊: "膜電位イメージング法によるナメクジ中枢神経系における嗅覚情報処理機能の研究" ファルマシア. 32. 37-42 (1996)
• [文献書誌] Hiroshi Tokumaru: "Three Types of Calcium Channels Co-exist in Electric Organ Synaptosomes" Neuroscience. (印刷中). (1996)
• [文献書誌] Chie Fujiwara-Hirashima: "A Voltage-dependent Anion Channel from Tetrahymena Ciliary membrane In corporated into Planar Lipid Bilayers" Biochim. Biophys. Acta. (印刷中). (1996)
• [文献書誌] 桐野 豊: "ナメクジ中枢神経系の光生理学的研究" バイオイメージ. (印刷中). (1996)
• [文献書誌] 桐野 豊: "続医薬品の開発、第17巻.薬物の構造解析と医薬品開発" 廣川書店, 306 (1995)
• [文献書誌] 桐野 豊: "シナプス伝達のダイナミクス" 培風館, 146 (1995)