| 研究概要 |
我々は効率良い形質発現ベクターを作成するために、動物細胞で安定にプラスミド状態で存在するベクターの開発を行っている。そのために、種々の動物細胞遺伝子上にDNA複製開始領域を同定し、それを母体として、そこにtransに機能するタンパク質因子との相互作用を利用して高効率なベクターを検索している。
1)新たなDNA複製開始領域の同定とプラスミド化
今までに、c-myc,N-myc,hsp70,免疫グロブリンH鎖遺伝子上にDNA複製開始領域を同定した。今年度更に、癌抑制遺伝子であるp53遺伝子上のDNA複製開始領域を検討したところ、上記の遺伝子群と異なって最終エキソン下流約1000-2000塩基対にDNA複製開始領域が存在した。種々の欠損変異を導入して必須領域を検討したところ、約1000塩基対を必要とし、かつp53認識配列および折れ曲がりDNA配列を必要とした。
2)c-myc遺伝子複製開始領域に結合するタンパク質
c-myc遺伝子複製開始領域,myc(H-P),配列にはC-MYC複合体が結合し、その一つの候補としてMSSPを同定し、2種類のcDNAをクローニングした。MSSPはそのC末でC-MYCのN末と結合する。また、MSSPはmyc(H-P)の1本鎖、2本鎖DNAに結合する。新たに、C-MYCそのものが、そのN末領域によりmyc(H-P)の1本鎖プラス鎖に塩基配列特異的に結合することが判明した。MSSPとはその認識配列を一部共有しており、拮抗的に作用した。
3)hsp70遺伝子上の複製開始領域に結合するタンパク質
この領域もC-MYC複合体が認識することを報告している。そこで,One hybrid systemによりこの配列に結合するタンパク質cDNAをまずクローニング、次にこれらをC-MYCとの結合を指標としたTwo hybrid systemでクローニングし、2種類の新規クローンを得、解析している。
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