| 研究課題/領域番号 |
07557149
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
山添 康 東北大学, 薬学部, 教授 (00112699)
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| 研究分担者 |
熊谷 博道 旭硝子株式会社, 中央研究所, 主任研究員
田井中 均 アマシャム株式会社, 総合研究所, 研究員
鈴木 真也 東北大学, 薬学部, 教務職員 (40196829)
永田 清 東北大学, 薬学部, 助手 (80189133)
出川 雅邦 東北大学, 薬学部, 助手 (50134002)
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| キーワード | 薬物代謝 / チトクロームP450 / cDNA発現 |
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| 研究概要 |
ヒト肝のcDNAライブラリーから単離したチトクロームP450分子種のcDNA(CYP2C9)をヒトサイトメガロウイルスのプロモーターを含む発現に組込み、S.pombe酵母を形質転換させた。G418選択マーカーによって目的クローンを選択し、さらにP450の発現を間接蛍光抗体法で確認した。得られたクローンのP450発現の効率に差が認められたので、培養条件の検討を行った。
3種の培地(YEL,YPD,SD)とpHおよび菌体濃度の関連を比較した結果、late stationaryになると細胞が堅くなり、Zymolyase処理の効率が低下し、P450のレベルも低下することがわかった。これらの結果からYPD培地で初発の100倍である1×10^8個/ml程度に増殖した時点で最も効率よく回収できることがわかった。この条件で調製したCYP2C9の発現量は、約0.2nmol/mg蛋白とかなりの高い値が得られた。ついで薬物代謝能を調べたところ、CYP2C9はKm83.3μM,Vmax330pmol/nmol P450/minの値を示し、しかもこの活性はスルファフェナゾール添加によって阻害された。これらのデータからS.pombe発現系はヒト薬物代謝の代替系として十分に機能しうることが確認された。
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