| 研究課題/領域番号 |
07557155
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
川さき 敏祐 京都大学, 薬学部, 教授 (50025706)
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| 研究分担者 |
竹内 誠 キリンビール基盤技術研究所, 主任研究員
鈴木 明身 東京都臨床医学総合研究所, 部長 (70134533)
小堤 保則 京都大学, 薬学部, 助教授 (70205425)
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| キーワード | N-グリコリルノイラミン酸 / 遺伝子クローニング / ノックアウトマウス |
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| 研究概要 |
抗原性糖鎖合成能を欠く医療用生物のうち、本年度はN-グリコリルノイラミン酸を有しないマウス及び細胞の作成を目指して研究を進めた。すでに我々はN-グリコリルノイラミン酸合成を司るCMP-N-アセチルノイラミン酸水酸化酵素のcDNAをマウス肝臓より単離している。そこで、このcDNAの情報をもとにのノックアウト動物を作製するための研究の一貫として、まずこの酵素のゲノム遺伝子をBalb/cマウス肝臓由来のゲノム遺伝子ライブラリーより単離した。λファージベクターに挿入されたマウス肝臓ゲノムライブラリーのプラークを5*10^5個スクリーニングし、合計14個のクローンを得た。単離されたクローンの解析の結果、ここで得られたクローンではこの酵素遺伝子の全長はカバーされておらず、全長をカバーするためにジーンウォーキングを行った。最終的に得られたクローンは21個であった。これらの解析より本酵素遺伝子は全長100kbを越す大きな遺伝子である事が明らかとなった。また、本酵素のcDNA部分に対応するプライマーを標識したプローブを用いたこれらλファージのクローンDNAのサザンブロット解析の結果、本酵素mRNAをコードするエキソンは17個以上あることが明らかとなった。この内の第4エキソンにneo遺伝子を導入したノックアウト用ベクターを構築し、ES細胞に導入したのち、G418によるセレクションにより335個のコロニーをえた。現在、これらについて組換えが正しく起こりCMP-NeuAc水酸化酵素遺伝子が破壊された細胞を得る操作すすめている。
また、N-グリコリルノイラミン酸を有しないCHO細胞を作成することを目的として、マウス由来のCMP-NeuAc水酸化酵素cDNAをプローブとして、CHO細胞由来のcDNAlibararyをスクリーニングしCHO細胞由来のCMP-NeuAc水酸化酵素cDNAのクローニングえた。さらに、CHO細胞由来のCMP-NeuAc水酸化酵素の遺伝子を単離した。これを用いて細胞レベルでの遺伝子ノックアウトをすすめた。
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