肥満細胞と好中球をモデル系としたアラキドン酸カスケード開始反応の統一的理解

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557160
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 工藤 一郎 昭和大学, 薬学部, 教授 (30134612)
• 研究分担者: 北口 暢哉 旭化成工業株式会社, ライフサイエンス基礎研究所・創薬科学研究室, 室長 ; 大石 幸子 北里大学, 薬学部, 教授 (70050416)
• キーワード: ホスホリパーゼA_2 / シクロオキシゲナーゼ / 肥満細胞 / 好中球 / プロスタノイド / 即時相 / 遅発相 / サイトカイン

研究概要

本年度は現在までに肥満細胞、好中球と、それ以外の細胞としてマクロファージ、繊維芽細胞、骨芽細胞を用いた系で成果が挙がってしる。
肥満細胞 肥満細胞におけるホスホリパーゼA2(PLA2)およびその下流に位置する酵素、シクロオキシゲナーゼ(COX)各分子種の刺激による発現、機能調節の解析を継続し、以下の新知見を得た。
(1)マウス肥満細胞をIL-10+IL-1β共存下IgEと抗原で処理すると、刺激後数分以内に起こる即時的なPGD2産生に続いて、刺激後2時間から10時間にかけて徐々に進行する遅発型PGD2産生が観察された。即時相では、常在型分子種であるcPLA2とCOX-1の活性化が見られた。一方、遅発相では、誘導型分子種であるsPLA2とCOX-2の強い発現誘導が観察された。各酵素に対する選択的阻害剤を用いた解析により、遅発相におけるPGD2産生はsPLA2とCOX-2に依存することが示唆された。今後更に、sPLA2の遅発相への関与を、遺伝的にsPLA2を欠損している129マウス由来の肥満細胞を用いて確認する予定である。
(2)刺激したマウス肥満細胞よりsPLA2をクローニングし、これをCHO細胞に導入して安定変異株を得た。この細胞におけるアラキドン酸代謝の変動を解析し、(1)の肥満細胞で得られた結果と照合している。
(3)今回新たに肥満細胞が新しいsPLA2分子種を発現していることが明かとなった。従来のsPLA2がCysを14残基持っているのに対し、本酵素は16残基持っていることから、便宜上C16-sPLA2と呼ぶ。肥満細胞におけるC16-sPLA2の発現は様々な刺激によっても変わらなかった。C16-sPLA2のcDNAをラット精巣より単離し、哺乳動物細胞及び昆虫細胞発現ベクターに組み込み、各々に発現させた。現在リコンビナント酵素の性状を解析中である。
好中球 FMLPまたはザイモザン刺激直後数分以内に起こるcPLA2の活性化の上流にホスホリパーゼDが存在することを明らかにした。
その他の細胞 以下の細胞におけるcPLA2とsPLA2の発現の変化を調べた。
(1)マクロファージ:ペプトン誘導ラット腹腔マクロファージをLPSで刺激すると、PGE2産生が遅発相のみで認められた。このとき、COX-2の強い誘導と、cPLA2の増加が見られた。sPLA2は逆に減少した。
(2)線維芽細胞:ラット線維芽細胞株3Y1をIL-1β+TNFαで刺激すると、sPLA2の発現が著しく誘導された。
(3)骨芽細胞:ラット新生児頭蓋骨芽細胞をIL-1βで刺激すると、sPLA2の発現が著しく誘導された。
以上の結果を通じて、プロスタノイド産生に関与するPLA2及びCOX分子種を統一的に説明すべく解析を続けている。

研究成果

• [文献書誌] Murakami, M. et al.: "Secretory Phospholipases A_2" J. Lipid Med. Cell Signalling. 12. 119-130 (1995)
• [文献書誌] Suga, H. et al.: "Exogenous Type II Phospholipase A2 Stimulates PGE2 Synthesis in Rat Liver BRL-3A Cells in the Presence of TNF" J. Biochem. (Tokyo). 118. 939-945 (1995)
• [文献書誌] Hara, S. et al.: "Detection and Purification of Two 14 kDa PLA2 Isoforms in Rat Kidney; Their Role in Eicosanoid Synthesis" Biochim. Biophys. Acta. 1257. 11-17 (1995)
• [文献書誌] Yokoyama, K. et al.: "Phospholipd Degradation in Rat Calcium Ionophore-Activated Platelets Is Catalyzed Mainly by Two Discrete SecretoryPLA" J. Biochem. (Tokyo). 117. 1280-1287 (1995)
• [文献書誌] Naraba, H. et al.: "Activation of PLA2 and Acylation of Lysophospholipds: The Major Regulators for PAF Production in Rat Neutrophils" J. Biochem. (Tokyo). 118. 442-447 (1995)
• [文献書誌] Ueno, A. et al.: "Involvement of Bradykinin in Endotoxin-induced Vascular Permeability Increase in the Skin of Rats" Eur. J. Pharmacol.284. 221-214 (1995)