機能ドメイン発現系を用いたセリン/トレオニン蛋白質リン酸酵素制御モデルの開発

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557200
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 吉川 潮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (40150354)
• 研究分担者: 小西 博昭 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (40252811) ; 黒田 俊一 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (60263406)
• キーワード: プロテインキナーゼ / 機能ドメイン / RACプロテインキナーゼ / プロテインキナーゼC / 融合蛋白質 / 分子ファミリー / 蛋白質相互作用 / 免疫沈降法

研究概要

RACプロテインキナーゼ(RAC-PK)はその構造のカルボキシル末端側にリン酸化酵素触媒ドメインを持ち、そのアミノ末端則に最近その存在が示された新しい機能ドメイン、PHドメインを持ち、RAC-PKのPHドメインにはプロテインキナーゼC(PKC)が結合することが明らかにされている。PHドメインはホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸等のリン脂質と結合し、また、PKCは脂質性メディエーターに変換された生理活性物質の情報を認識することから、セリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素の制御モデルとしてRAC-PKのPHドメインとPKCとの相互作用を検討を実施した。まず、RAC-PKのサブタイプの検索を行ない、存在の知られていたαおよびβ以外に新規クローンγを得た。これら3種類のRAC-PKの間でそのPHドメインおよびリン酸化酵素触媒ドメインはホモロジーが高く、両ドメインの間に介在する領域は類似性が低いことが示された。これら3種類のRAC-PKを培養細胞に発現し単一蛋白質として精製し、その酵素活性を測定したところ、その比活性はPKCの百分の一程度と低く、RAC-PKには何らかの活性調節機構が存在することが示唆された。そこで、3種類のRAC-PKのそれぞれのPHドメインをGST融合蛋白質として発現し、試験管内でPKC分子種との結合を検討した結果、cPKC,nPKC、aPKCグループのPKC分子種がいずれもRAC-PKのPHドメインと結合することが示された。そこで、細胞内でのRAC-PKとPKCとの結合を共発現細胞からの免疫沈降法により解析したところ、RAC-PKとPKCとの結合には組合わせがあり、また、細胞刺激によりその結合が増強されることが明らかになった。次年度は上記の成果に基づきRAC-PKとPKCの相互作用の分子機構の解析を実施する。

研究成果

• [文献書誌] Konishi, H.: "Molecular cloning and characterization of a new member of the RAC protein kinase family : association of the pleckstrin homology domain of three types of RAC protein kinase with protein kinase C subspecies and βγ subunits of G proteins." Biochem. Biophys. Res. Commun.216. 526-534 (1995)
• [文献書誌] Takanaga, H.: "Functional characterization of the promoter region of the mouse protein kinase Cγ gene." FEBS LCTT.368. 276-278 (1995)
• [文献書誌] Kasahara, K.: "Distinct effects of satuvated fatty acidson prote in kinase C subspecies" J. Biochem.117. 648-653 (1995)
• [文献書誌] Nakamura, F.: "Characterization on Gq family G proteins GL1α (G14α),GL2α (G11α),and Gqα expressed in the baculovirus-infected cell system." J. Biochem.270. 6246-6253 (1995)
• [文献書誌] Igarashi, K.: "A novel phospholipid-binding peptide motif defined by and anti-idiotypic monoclonal antibody. Localization of phosphatidylsefine-specitic binding sites on protein kinase C and phosphatidylserme decarboxylase." J. Biol. Chem.270. 29075-29078 (1995)
• [文献書誌] Oka, M.: "Differential down-regulation of protein kinase C subspecies in normal human melanocytes : possible involvement of the ζ subspecies in growth regulation." J. Invest. Dermatol.105. 567-571 (1995)