| 研究課題/領域番号 |
07557215
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
榎並 正芳 金沢大学, 医学部, 助教授 (30168794)
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| 研究分担者 |
中田 進 山ノ内製薬(株), 筑波研究センター, 主管研究員 (90129255)
佐藤 威 国立予防衛生研究所, ウイルス製剤部, 主任研究官 (00221284)
小田切 孝人 自治医科大学, 医学部, 講師 (80177237)
豊田 哲也 久留米大学, 医学部, 教授 (00197972)
永田 恭介 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40180492)
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| キーワード | インフルエンザ / 遺伝子操作 / ベクター / ワクチン / 転写 / 複製 / 宿主因子 / サブジェノミックRNA |
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| 研究概要 |
1)インフルエンザウイルスNA分節に、IRESを介在配列として約100-1800bpの種々の外来遺伝子を導入したウイルスの回収を試みた。短い遺伝子は安定に導入されたが、発現は極めて低かった。最も長い遺伝子として麻疹HA遺伝子を導入したウイルスを回収したが、HA遺伝子の約70%を欠失していた。既存の技術を用いたインフルエンザベクター系には発現レベルと安定性に問題のあることが判明した。
2)そこで、インフルエンザゲノム中最もサイズが小さく遺伝子発現レベルの高いNSゲノムを当面の標的とし、新たな遺伝子組み替え技術の開発を行った。ウイルス粒子から単離したRNPをNSのcDNA存在下RNaseHで処理し、NSのcDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを回収した。NLS2(核移行シグナル2)及びエフェクタードメインを含むC端側半分を削除すると、ウイルスは弱毒化した。N端側半分に12残基の欠失を持つウイルスは温度感受性となった。ウイルス弱毒化のプロトコールが得られた。さらに現在、種々の外来遺伝子をNSゲノムへ2Aプロテアーゼ配列を介在配列として導入し、ウイルスの回収と発現の解析を行っている。
サブジェノミックRNAの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された。今後サブジェノミック型ベクター開発にはこの領域への特異導入が必要である。
4)インフルエンザウイルスRNA転写・複製を促進する宿主因子RAFを同定した。今後、大量発現のヘルパー細胞としてRAFの過剰発現が利用可能と思われる。
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