癌化、進展に関与する発現遺伝子の新たな検出法の開発

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557235
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 沢田 淳 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (10079874)
• キーワード: 発現遺伝子の検出法 / FISH法 / 蛍光プローブ / 画像処理

研究概要

癌の発生、進展に関与する発現遺伝子を検出する方法を開発する目的で、遺伝子上で実際に発現している遺伝子領域をvisualに検出する手段として、Comparative mRNA Hybridization(CmRH)を考案した。
本手法は、(1)目的の新鮮組織、培養細胞より、oligo(dT)primerと逆転写酵素を用い、cDNAを作製した後、これをNick translationにてbiotinあるいはdigoxigenin標識する。(2)これを正常リンパ球のmetaphase上にhybridizationさせた後、FITC(緑)、Rhodamin(赤)で二次標識する。(3)蛍光顕微鏡とCCDカメラにて高解像・高感度に検出し、画像処理にて緑と赤の蛍光量を比較・定量化する。以上の3つのstepからなる。
平成7年度は、total RNAからのcDNA probe作製技術の確立に重点を置いた。当初の計画では、oligo(dT)primer,biotin-dUTP,digoxigenin-dUTP存在化に、逆転写酵素を用い直接に標識する計画であったが、この方法では、probesizeが2-3kbとなり(長すぎる)、制限酵素を用いる必要がでた。このため、いったんcDNA作製後、Nick translationで標識することにより、500-1000bpの至適sizeのprobe作製に成功した。CCDカメラ・画像解析装置の導入はすでに終了し、平成8年度はstep(2)、(3)に入れる状況である。

研究成果

• [文献書誌] Sawada,T.et al.: "Analysis of 598 cases of neuroblastoma(NB) detected by screening and changes in the age distribution and incidence of NB patients after mass screening in infants in Japan" Advances in Neuroblastoma Research. 4. 371-375 (1994)
• [文献書誌] Sawada,T.et al.: "Neuroblastoma mass screening in Japan" New Trends in Neonatal Screening. 1. 174-176 (1994)
• [文献書誌] Akane Shikata,Tadashi Sawada et al.: "Increased expression of trk proto-oncogene by γ-Interferon in human neuroblastoma cell lines" Japanese Journal of Cancer Research. 85. 122-126 (1994)
• [文献書誌] 沢田淳 他: "神経芽細胞腫" 小児内科. 26. 1973-1978 (1994)
• [文献書誌] 杉本徹,沢田淳 他: "神経芽腫の細胞分化と分化誘導療法" Biotherapy. 9. 862-872 (1995)
• [文献書誌] Takeo Tanaka,Tadashi Sawada et al.: "Trk A gene expression in neuroblastoma" Cancer. 76. 1086-1095 (1995)
• [文献書誌] 杉本徹,堀井由博,沢田淳: "神経芽腫・癌細胞の分化誘導とアポトーシス" 共立出版, 230 (1995)