癌化、進展に関与する発現遺伝子の新たな検出法の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557235
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 沢田 淳 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (10079874)
• キーワード: 発現遺伝子の検出法 / FISH法 / 蛍光プローブ / 画像処理

研究概要

癌の発生、進展に関与する発現遺伝子を検出する新たな方法を開発する目的で、遺伝子上で実際に発現している遺伝子領域をvisualに検出する手段として、Comparative mRNA Hybridization (CmRH)を考案した。
本手法は、(1)目的の新鮮組織、培養細胞より、oligo (dT) primerと逆転写酵素を用い、cDNAを作製した後、これをNick translationにてbiotinあるいはdigoxigenin標識する。(2)これを正常リンパ球のmetaphase上にhybridizationさせた後、FITC (緑)、Rhodamin (赤)で二次標識する。(3)蛍光顕微鏡とCCDカメラにて高解像・高感度に検出し、画像処理にて緑と赤の蛍光量を比較・定量化する。以上の3つのstepからなる。
平成8年度は、(1)cDNAからbiotinあるいはdigoxigenin標識したprobeを作製し、(2)正常リンパ球のmetaphase上にhybridizationさせ、(3)実際に観察を行った。この結果以下の問題点が明らかになった。
cDNA pbobeの場合、DNA probeよりhybridizationの効率が悪い。この原因はcDNA probeの場合イントロンを含まないためDNAとのhybridizagtionにおいて、イントロン領域でミス・マッチを生じるためと推測される。
この問題点は本手法の可否を決定する重要な課題であり、現在、probe sizeをより短くし同一probe内に複数のエクソンを含む割合を減らす、hybridization後の洗浄のstringencyを下げる、によって解決可能か検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Hiroyuki Ishida, Tadashi Sawada et al.: "MAGE-1 AND MAGE-3 CR-6 EXPRESSION IN NEOROBLASTOMA-RELATED PEDIATRIC SOLID TUMORS" Int. J. Cancer. 69. 375-380 (1996)
• [文献書誌] Sawada T. et al.: "Neuroblastoma mass screening in Japan" New Trends in Neonatal Screenign. 1. 174-176 (1994)
• [文献書誌] Takeo Tanaka, Tadashi Sawada et al.: "TrK A gene expression in neuroblastoma" Cancer. 76. 1086-1095 (1995)
• [文献書誌] 杉本徹、沢田淳他: "神経芽腫の細胞分化と分化誘導療法" Biotherapy. 9. 862-872 (1995)
• [文献書誌] 沢田淳他: "神経芽腫" 小児内科. 28. 1126-1130 (1996)
• [文献書誌] Sohheil koshizawa Tadashi Sawada et al.: "Areration of midkine expression associated with chemically-induced differentiation in human neuroblactoma cells" Cancer Letters. 111. 117-125 (1997)
• [文献書誌] 杉本徹、堀井由博、沢田淳: "神経芽腫・癌細胞の分化誘導とアポトーシス" 共立出版, 230 (1995)