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我々は、(1)前処理機能付オートサンプラー、送液用グラジェンター、イナ-ト型高圧ポンプ、サーマルコントローラ、フロー式モニター、フラクションコレクター及びコンピューターから構成される全自動式DNA診断システムのハードウェアを構築し、自動化のための装置、部品類、ソフトウェアなどを整備した。(2)HPLC用の樹脂担体に12b〜数kb鎖長の核酸プローブを効率良く固相化する技術を確立した。(3)被検DNA断片の末端標識技術を開発し、極微量の標的DNAを蛍光標識プライマーによって特異的にPCR増幅して、高感度検出する技術を確立した。(4)本システムの基本原理を塩基配列特異的熱溶出クロマトグラフ法(SSTEC法)と定めて、本システムの分離・分析条件の評価を行った。その結果、SSTECパターンのピーク位置は、融解温度(Tm値)に一致することが分かり、測定精度は±0.1°C以下と、従来法より十倍以上も高精度であることが判明した。また、分解能が高く、0.2°CのTm値の差は、SSTECパターン上で十分識別可能であった。(5)ウシ性決定遺伝子(bSRY)の一部の塩基配列を固相プローブとして用い、(1)塩基配列の違いに基づくTm値の違い、(2)一塩基変異の及ぼすTm値への影響、(3)変異部位の違いによるTm値の影響などを検討した。その結果、本法では、たとい一塩基の遺伝子変異でも十分検出可能なことが分かった。(6)675及び60塩基のbSRY-DNAプローブを用い、各種DNAポリメラーゼでPCR増幅した試料のSSTEC解析を行った。その結果、フィデリティーの高い酵素ではTm値変化を示さなかったが、675塩基のプローブを用いたTaqポリメラーゼの実験では、増幅回数が多い程Tm値の低下が顕著であった。これは、本法が、ポリメラーゼのフィデリティー解析に応用可能なことを示すものとして興味深い。
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