| 研究課題/領域番号 |
07557302
|
|---|
| 研究種目 |
試験研究(B)
|
| 研究機関 | 帝京大学 |
|---|
研究代表者 |
瀬高 守夫 帝京大学, 薬学部, 教授 (70012630)
|
|---|
| 研究分担者 |
藤田 政満 日清食品, 東京研究所, 研究員
横山 和明 帝京大学, 薬学部, 助手 (50246021)
佐藤 典子 帝京大学, 薬学部, 助手 (80162460)
唐沢 健 帝京大学, 薬学部, 講師 (50186029)
|
|---|
| キーワード | PAF / PAFアセチルヒドロラーゼ / PAFアセチルトランスフェラーゼ / タンパク精製 / 遺伝子クローニング |
|---|
| 研究概要 |
血漿PAFアセチルハイドロラーゼの遺伝子クローニング
モルモット血漿より精製した本酵素の、部分アミノ酸配列に基づいたプライマーを用いて、PCR法によりcDNAフラグメントを得た。このcDNAフラグメントをプローブとしてモルモットおよびヒトcDNAライブラリーをスクリーニングすることによりこれらの酵素遺伝子を単離することに成功した。DNA 塩基配列解析の結果、モルモット酵素は436アミノ酸、ヒト酵素は431アミノ酸から成ることが推定された。両酵素分子の一次構造を比較すると、アミノ酸レベルでは 67%のホモロジーを有していた。モルモット酵素の推定分子量(49kDa)は、酵素精製の結果(63 kDa)よりかなり小さいのに対し、ヒト酵素の推定分子量(45 kDa)は、精製タンパクの分子量(44 kDa)とよく一致していた。モルモット酵素はレクチンカラムへ吸着する点、および3箇所のアスパラギン結合糖鎖のコンセンサス配列を有する点でヒト酵素と異なっていたが、これが糖鎖修飾によるものである可能性が強く示唆された。
PAF合成酵素の単離・精製
当該年度はPAF合成酵素を精製するための予備研究として、活性測定方法の簡便化、安定性、細胞膜からの可溶化条件についての検討を行った。まず、従来の薄層クロマトグラフィーに替わる、溶媒分画を用いた簡便な活性測定法を確立した。次に、SH基保護試薬を添加すると安定に保存できることを見いだした。この酵素は海面活性剤により速やかに失活した。このことから、膜画分からの可溶化は困難と考えられ、現在、放射標識された活性阻害剤を用いてこの酵素の同定を試みている。
|
