| 研究課題/領域番号 |
07557302
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
瀬高 守夫 帝京大学, 薬学部, 教授 (70012630)
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| 研究分担者 |
藤田 政満 日清食品, 東京研究所, 研究員
横山 和明 帝京大学, 薬学部, 助手 (50246021)
佐藤 典子 帝京大学, 薬学部, 助手 (80162460)
唐沢 健 帝京大学, 薬学部, 講師 (50186029)
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| キーワード | PAF / PAFアセチルヒドロラーゼ / PAFアセチルトランスフェラーゼ / タンパク精製 / 遺伝子クローニング |
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| 研究概要 |
1.PAFアセチルヒドロラーゼ遺伝子の発現と病態との関連についての解析
前年度に単離したモルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼcDNA(436アミノ酸、推定分子量49kDa)を、His tagを持つベクターに組み込み大腸菌に発現させ、Ni+カラムおよびSDS-PAGEによってリコンビナント酵素を精製し、本遺伝子産物が酵素活性を担うタンパクであることを確認した。このタンパクをウサギに免疫して得た特異的抗体でウェスタンブロッティングを行ったところ、モルモット血漿中の分子量63kDaのタンパクと反応した。この結果は酵素精製標品(63kDa)とよく一致するが、遺伝子より予想される分子量より大きく、糖鎖付加などの翻訳後修飾が行われている可能性を示唆している。この生理的意義については今後検討すべき課題である。
本酵素の転写調節による発現制御の機構を探るため、cDNAの5'近傍の200塩基からなるDNAフラグメントをプローブとしてゲノムDNAのクローニングを実施中である。今後、プロモーター領域の解析と免疫化学的手法を組みあわせることにより、本酵素の発現調節機構と病態への関与についてを解析していく方針である。
2.PAFアセチルヒドロラーゼ遺伝子の生体内導入
血漿PAFアセチルヒドロラーゼ遺伝子のcDNAをin vitroおよびin vivo導入するために、導入効率の高いアデノウイルスベクターに挿入した組換えベクターを作製した。COS細胞にこのベクターを感染させることによって、培養上清のPAFアセチルヒドロラーゼが著しく増加し、導入遺伝子の発現が引き起こされることが確かめられた。
3.アセチルトランスフェラーゼ酵素タンパクの単離精製
種々の界面活性剤を検討したが、可溶化は難しく、現在精製の途上である。
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