| 研究課題/領域番号 |
07557326
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
塩田 浩平 京都大学, 医学研究科, 教授 (80109529)
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| 研究分担者 |
塚原 正人 山口大学, 医学部, 助教授 (20136188)
石橋 誠 京都大学, 医学研究科, 助手 (30232341)
森 千里 京都大学, 医学研究科, 助教授 (90174375)
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| キーワード | FISH法 / 性染色体特異的遺伝子 / 性別判定 / 性分化異常 / ヒト胎児 / 分子診断 |
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| 研究概要 |
1)Fluorescent in situ hybridization(FISH)法による固定組織切片上での特異的DNA塩基配列の検出
ヒトのXおよびY染色体に特異的なDNA配列に対するプローブDXZlおよびDYZl(oncor社製)を用い、ヒト胎児固定標本の切片でFISH法を施行した。その結果、パラホルムアルデヒド(PFA)固定後24時間以内に包埋した組織については良好なシグナルが得られ、男性胎児の組織では細胞核ごとにDXZlとDYZlに対するシグナルがそれぞれ1個ずつ、女性胎児の細胞ではDXZlに対するシグナルのみが核に2個ずつ検出された。これにより、固定胎児標本を用い、FISH法で特定遺伝子のシグナルを検出できることが明らかになった。
2)ヒト胎児組織を用いてFISH法を行うための至適条件の検討
DXZlおよびDYZlのプローブを用いてFISH法を行う場合の標本の処理方法を検討した。4%PFAまたは10%ホルマリンで固定した標本ではFISH法によるシグナルが検出されたが、ブアン固定した標本では検出されなかった。またPFAで固定した場合、固定液中に1週間以上置くと反応が弱くなった。Proteinase K処理は45〜60分間が適していたが、組織によって至適処理時間は異なっていた。以上から、ヒト胎児組織を用いてFISH法を行うためには新鮮な組織を4%PFA、4℃で固定した後、24〜48時間で包埋し、4〜6μmの厚さの切片を作成して反応を行うのがよいと判断された。なお、この方法を用いた場合、パラフィン包埋後少なくとも5年間までの標本については良好なFISHのシグナルが得られることが明らかになった。
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