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◇不死化運動ニューロンを用いたsubtractiorr cDNA libraryの作成と、運動ニューロン特異的遺伝子のクローニング:不死化運動ニューロン(マウス運動ニューロン×neuroblasoma細胞株のハイブリッド細胞株)を用いて元のneuroblasoma細胞株との間でsubtraction cDNA libraryを作成した。ランダムに200クローンを選択してdefferential screeningをおこなったところ、発現量に明らかに差のある9クローンを得た。その内、3クローンにつきadultマウスの各機器を用いてノーザンブロット解析を行ったところ、1つは中枢神経系(大脳、小脳、脊髄)優位に発現しており、シークエンスの結果amyloid precursor like protein geneであった。他の2つはこの細胞のみに発現しており、adultのマウス組織(大脳、小脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、腎臓)にも発現は見られなかった。シークエンスの結果はいずれも未知の遺伝子であり、不死化運動ニューロンが胎仔期のE12-E15の頃の運動ニューロンの由来であることより、運動ニューロンの発生分化に関係ある遺伝子の可能性があると考え、ノーザンブロットやin situ hybirdizationによりdevelopmetalな発現を検討している。この1つはhomology検索より、多くのreceptor geneや膜蛋白とのhomologyが見られ、何かのreceptor geneの可能性があり、平行して全長クローニングを行っている。また、残りの6クローンについてもシークエンスによる検討を行っているところである。
◇Single cellでの解析:予備実験として、培養神経細胞を限界希釈して、そこから微小ガラス管を用いて数個(5個程度)の細胞からmRNAを抽出し、cDNAを合成を行なった。PCR用のtagをつけたアダプターをライゲーションした後、PCRを行ない電気泳動で確認したところ、きれいなDNAのsmearが得られることを確認した。今後の予定として、新生児ラットのmotor neruonをretrograde labellingにより標識してvibratome切片を作成し、その切片上で微小ガラス管を用いてmRNAの採取を行い、mRNA differential displayにより運動ニューロン特異的遺伝子を検討する。
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