組替え受容体と化学発光を用いた甲状腺刺激ホルモン受容体抗体のアッセイ系の開発

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557353
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小杉 眞司 京都大学, 医学研究科, 助手 (50252432)
• 研究分担者: 笹嶋 政昭 チバコーニング, ダイアグノスティクス株式会社・開発部, 研究員 ; 赤水 尚史 京都大学, 医学研究科, 助手 (20231813) ; 須川 秀夫 京都大学, 医学研究科, 講師 (70162857) ; 森 徹 京都大学, 医学研究科, 教授 (40026894)
• キーワード: TSH受容体 / 組替え受容体 / 化学発光 / 抗受容体抗体 / 固相化 / 甲状腺 / CHO-K1細胞 / Hela S-3細胞

研究概要

まず、リコンビナントTSH(甲状腺刺激ホルモン)受容体蛋白のソースであるが、われわれが以前より使用しているCHO-K1細胞にTSH受容体cDNAをパ-マネントにトランスフェクションした細胞株のみでなく、ヒト由来の細胞株であるHela S-3細胞のトランスフェクション細胞株を樹立した。これもTSHに対する反応性、TSH結合性は良好で、CHO-K1細胞よりもより浮遊培養が容易であることから、大量の受容体蛋白のソースとして有用と考えられる。
TSH受容体の鉄微粒子(PMP)への固相化であるが、当初考えていた抗DNP(ジニトロフェノール)を直接PMPに結合させ、DNP-燐脂質とTSH受容体を含むマイクロゾームで間接的固相化を行う方法は、マイクロゾームの安定的生産が困難なことより断念した。それにかわって、抗受容体抗体をPMPに結合させる間接法を現在検討中である。抗受容体抗体としては、(1)受容体N末端部にインフルエンザヘマグルチニンなどの6-9のアミノ酸配列を挿入し、それに対する特異抗体を用いるエピトープタッグ法、(2)受容体機能に影響のないことを確認しているC末尾部に対する抗体、(3)細胞外領域のdeletable loop内部に相当し、やはり受容体機能に影響のないことを確認しているアミノ酸残基352-366に相当するペプチドP1にたいする抗体などを間接固相化のために用いて検討中である。特に(3)のP1抗体を用いる方法に現在よい結果を得ている。

研究成果

• [文献書誌] Kosugi S., et al.: "Characterization of heterogeneous mutations causing constitutive activation of luteinizing hormone receptor in familial male precociouspuberty." Human Molecular Genetics. 4. 183-188 (1995)
• [文献書誌] Ueda Y., Sugawa H. et al.: "Thyroid-stimulating antibodies in sera from patients with Graves' disease are heterogeneous in epitope recognition." Eur J Endocrinol. 132. 62-68 (1995)
• [文献書誌] 小杉眞司: "下垂体性糖蛋白ホルモン受容体の機能的解析と臨床応用" 興和生命科学振興財団研究報告集. 6. 160-167 (1995)
• [文献書誌] 小杉眞司: "下垂体性糖蛋白ホルモン(TSH, LH, FSH)受容体の構造と機能の解析と甲状腺、性腺の難治性疾患治療への臨床応用" 持田記念財団研究成果報告集. 11. 168-175 (1995)
• [文献書誌] 小杉眞司: "プランマー病のTSH-R遺伝子変異" Modern Physician. 15. 777-780 (1995)
• [文献書誌] 小杉眞司、森徹: "黄体化ホルモン受容体の活性化型変異" 医学のあゆみ. 173. 714-715 (1995)
• [文献書誌] Kosugi S., Mori T.: "TSH receptor and LH receptor, 1995" Endocr. J. 42. 587-606 (1995)
• [文献書誌] Sugawa H, Akamizu T, Kosugi S. et al.: "Presence of heterogeneous thyroid-stimulating antibodies in sera from individual Graves' Patients as shown by synthesized thyrotropin receptor peptide application evidence showing two independent epitopes and a possible recognition of two epitopic regions by one antibody molecule." Eur. J. Endocrinol.133. 283-293 (1995)
• [文献書誌] Zhang ML, Sugawa H, Kosugi S. Mori T: "Constitutive activation of the thyrotropin receptor by deletion of a portion of the extracellular domain" Biochem. Biophys. Res. Commun.211. 205-210 (1995)
• [文献書誌] Li H, Akamizu T, Okuda J, Mori T Sugawa H, Matsuda F, Tsubata T.: "Isolation of Epstein-Barr-virus-transformed lymphocytes producing IgG class monoclonal antibodies using a magnetic cell separator (MACS): preparation of thyroid-stimulating IgG antibodies from patients with Graves'disease" Biochem. Biophys. Res. Commun.207. 985-993 (1995)
• [文献書誌] 小杉眞司、森徹: "臨床DNA診断法:黄体化ホルモン(LH)受容体異常症" 古庄敏行、井村裕夫編(金原出版), 3 (195)
• [文献書誌] Kohn L. D., Kosugi S. et al.: "Molecular Endoclinology: Basic Concepts and Clinical Correlations." ed. Weintraub B. D., Raven Press, New York, Cloning and regulation of glycoprotein hormone rereptor genes., 21 (1995)