組替え受容体と化学発光を用いた甲状腺刺激ホルモン受容体抗体のアッセイ系の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07557353
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小杉 眞二 京都大学, 医学研究科, 助手 (50252432)
• 研究分担者: 笹嶋 政昭 チバコーニング, ダイアグノスティクス株式会社・開発部, 研究員 ; 赤水 尚史 京都大学, 医学研究科, 助手 (20231813) ; 須川 秀夫 京都大学, 医学研究科, 講師 (70162857) ; 森 徹 京都大学, 医学研究科, 教授 (40026894)
• キーワード: 組み替え受容体 / 化学発光 / 甲状腺刺激ホルモン受容体 / 受容体自己抗体 / モノクローナル抗体 / 固相化 / tagged receptor / 疎水性クロマトグラフィー

研究概要

現在のTBII(甲状腺刺激ホルモン結合阻害イミュノグロブリン)測定系に放射性同位元素を用いない化学発光の系を導入し、甲状腺膜ではなくリコンビナントTSH(甲状腺刺激ホルモン)受容体蛋白を用いた、より特異的、簡便、高感度な方法を導入するための基礎検討を行った。
疎水性クロマトグラフィーを行うことにより、AE(アクリジウムエステル)標識TSHの特異性が向上した。TSH受容体固相化については、受容体機能に影響がないことが確認された、受容体細胞外領域C末端部deletable領域のアミノ酸配列をもつペプチドに対する抗体を用いて、間接的に鉄微粒子に結合させる方法に最も可能性があることが明らかとなった。また、特異抗体で認識される8ヶのアミノ酸配列を受容体N末端部に挿入した、いわゆるtagged receptorを樹立することに成功した。これも、受容体の間接的固相化に有用と考えられる。
TSH測定系にTSH受容体と自己抗体を加えて、標識抗TSH抗体とTSH受容体とのTSHに対する結合競合、さらに自己抗体とTSHの受容体に対する結合競合をみる、いわゆる"double competition"を、別角度からのアプローチとして行ったが、結合キャパシティの点で問題があり、実用的んではないことが明らかとなった。
測定の標準化に用いるTBII活性陽性モノクローナル抗体を、患者Bリンパ球をEBウイルスを用いてトランスフォームすることにより得ることに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Mori T,Sugawa H,Akamizu T,Kosugi S,Okuda J: "Laboratory tests necessary at the first examination of patients with suspected thyroid disorders." Endocr J. 43. 197-204 (1996)
• [文献書誌] Kosugi S,Mori T: "Cysteine-699,a possible palmitoylation site of the thyrotropin receptor,is not crucial for cAMP or phosphoinositide signaling but is necessary for full surface expression." Biochem Biophys Res Commun. 221. 636-640 (1996)
• [文献書誌] Kosugi S,Mori T: "Constitutive activation of the thyrotropin receptor by mutating Cys-636 in the sixth transmembrane segment." Biochem Biophys Res Commun. 222. 713-717 (1996)
• [文献書誌] Kosugi S,Sasaki N,Hai N,Sugawa H,Aoki N,Shigemasa C,Mori T,Yoshida A.: "Establishment and characterization of a Chinese hamster ovary cell line,CHO-4J,stably expressing a number of Na^+/I^- symporters." Biochem Biophys Res Commun. 227. 94-101 (1996)
• [文献書誌] Kosugi S,Mori T,Shenker A.: "The role of Asp^<578> in maintaining the inactive conformation of the human lutropin/choriogonadotropin receptor." J Biol Chem. 271. 31813-31817 (1996)
• [文献書誌] Yoshida A.Sasaki N,Mori A,Taniguchi S,Mitani Y,Ueta Y,Hattori K,Sato R,Hisatome I,Mori T,Shigemasa C,Kosugi S.: "Different electrophysiological Character of I^-,OIO_4 and SCN^- in the transport by Na^+/I^- symporter." Biochem Biophys Res Commun. (in press).
• [文献書誌] Kosugi S.,Sugawa H,Mori T: "TSH receptor and LH reoptor,1996." Endocr J. 43. 595-604 (1996)
• [文献書誌] Kosugi S.,Sugawa H,Mori T: "Epitope analysis of the thyrotropin receptor,1997." Mol Cell Endocrinol. in press. (1997)
• [文献書誌] 小杉眞司、森徹: "TSH受容体のアゴニストによる活性化機構。" 医学のあゆみ. 178. 273-277 (1996)
• [文献書誌] 小杉眞司: "TSH受容体の構造と機能・抗原部位。" Mebio. (印刷中). (1997)
• [文献書誌] Kosugi S.,Matsuda A,Hai N,Aoki N,Sugawa H,Mori T: "Aspartate-474 in the first explasmic loop of the thyrotropin receptor is crusial for receptor activation" FEBS Lett. (in press). (1997)
• [文献書誌] Shenker A,Kosugi S: "Activating mutations of the luteinizing hormone reoptor gene in familial testotoxicosis." In : Cellular and Molecular Regulation of Testicular Cells(ed Desjardins C.)Springer-Verlag,New York, 12 (1996)
• [文献書誌] 小杉眞司、Robert Barszczewski、須川秀夫、森徹: "甲状腺機能に対する喫煙産物の影響" 平成7年度喫煙科学研究財団研究年報, 5 (1996)
• [文献書誌] 小杉眞司、森徹: "家族性思春期早発症" Annunal Review 内分泌・代謝(中外医学社、編集:金澤康徳、田中孝司、武谷雄二、山田信博), 8 (1997)
• [文献書誌] 小杉眞司、須川秀夫、森徹。: "甲状腺機能に対する喫煙産物の影響(2)" 平成8年度喫煙化学財団研究年報(印刷中), (1997)