| 研究課題/領域番号 |
07558125
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
菅 健一 大阪大学, 工学部, 教授 (20029250)
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| 研究分担者 |
片倉 啓雄 大阪大学, 工学部, 助手 (50263207)
大政 健史 大阪大学, 工学部, 助手 (00252586)
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| キーワード | 人工肝 / 遺伝子組換え / MSX / GS / アンモニア |
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| 研究概要 |
遺伝子増幅系を用いた組換え動物細胞による肝機能補助システムの開発を目指して、本年度は増幅系を用いた人工肝細胞の構築(菅・片倉)のグループでは、実際にグルタミン合成酵素を含む遺伝子増幅用のベクターpSV2-GSを構築し、実際にハムスター卵巣細胞(CHO細胞)に遺伝子導入を行い、グルタミン合成酵素阻害剤(Methonine sulfoximine;MSX)存在下で、約120日間にわたって選択を繰り返し、高濃度MSX耐性株を獲得した。同時に、合成酵素阻害剤であるMSXの濃度を段階的に挙げる14通りのMSX上昇法を用いて、最適なMSX耐性株取得法について検討した。その結果、MSX濃度をだきるだけstep的に上昇させることにより、最も早く高濃度MSX耐性株を獲得することができた。構築した人工肝細胞の安定性、生産性、機能の定量的な解析(菅・大政)のグループでは、得られた耐性株のアンモニア消費について検討した。まず、グルタミン合成酵素活性の測定系を確立し、得られた耐性株において、実際にグルタミン合成酵素活性が上昇しているかどうかについて確認した。その結果、MSX濃度の上昇に伴って、グルタミン合成酵素活性の増加が見られ、遺伝子導入前のCHO野生株に比較して、約10倍活性が上昇していた。次に、得られた細胞株の中から4種類を選び出し、アンモニア代謝能について回分培養を行い、その培地中のアンモニア代謝について検討した。その結果、肝由来の初代肝細胞と比較して、ほぼ同等程度のアンモニア消費活性(細胞あたり、単位時間あたりのアンモニア消費)があることがわかった。
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