超好熱菌酵素による機能性人工膜

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07558128
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 香川 靖雄 自治医科大学, 医学部, 教授 (30048962)
• キーワード: Hyperthermophile / chaperone / biomembrane / racemase / ATPase / V-type ATPase / reconstitution / heat shock

研究概要

極度に安定な膜タンパク質を超好熱菌から得て機能性人工膜を作る目的で約100℃で増殖する超好熱菌Desulfurococcus sp.SY株(東太平洋産)から遺伝子を単離し構造決定して蛋白質、核酸の極限の高次構造を解明する。粗DNA分画は細菌をproteinase K、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton-Xで可溶化し、フェノール変性後にRNAaseで処理し、クロロフォルム抽出、エタノ-エル沈殿で得た。ハイブリッド形成法、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)。本年までに、数種の超好熱タンパク質遺伝子をクローニングし、タンパク質を大量発現させて精製した。
第一に、アスパラギン酸ラセマーゼについてその発現から機能について解明し、本年度のJ.Biol.Chem.にその詳細を報告した。
次に同菌から膜のエネルギー変換の中心であるV型ATPaseのオペロンをクローン化して、その構造を決定するとともに、大腸菌内で大量発現させて、そのサブユニットの詳細を解明した。意外なことに、ホモロジー検索では、この超好熱膜ATPaseは酸化的リン酸化能を持たないEnterococcus hiraeのNa-ATPaseと相同性が高かった。この内容を日本生化学会に報告すると共に、原著論文を完成中である。
また、前年度に引き続き、膜を含む高次構造を形成するのに必要なシャペロニンのα、βサブユニット遺伝子の全構造を決定するとともに、それらを大量発現させた。これはATPのエネルギーを用いて構造を形成する。そしてこのαβオリゴマーを用いて、実際に変性させた好熱菌酵素の構造をATP依存的に再現させることに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Yohda,M.,Kagawa,Y.: "Gene for aspartate racemase from the sulfur-depende. hyperthermophilic archaeum,Desulfurococcus strain." J.Biological Chemistry. 271. 22017-22021 (1996)
• [文献書誌] Kagawa,Y.Hamamoto,T.: "The energy transmission in ATP synthase : From the Gamma-c rotor to the alpha3 beta3 oligomer..." J.Bioenergetics and Biomembranes. 28. 421-431 (1996)
• [文献書誌] Kagawa,Y.: "Human cytochrome c oxidase analyzed with cytoplasts." Keio J.Medicine. 45. S16- (1996)
• [文献書誌] Kagawa,Y. Hayashi,J.: "Gene therapy of mitochondrial disease using..." Gene Therapy. 4. 6-10 (1997)
• [文献書誌] Uenaka,R.,Kagawa,Y.: "Increased Expression of carnitine palmitoyl trans.." J.Biochemistry. 119. 533-540 (1996)
• [文献書誌] Nakanishi,M.Kagawa,Y: "Two different bindings of p21 Cdk inhibitor to..." Leukemia. (in pres). (1997)
• [文献書誌] 香川靖雄: "老化のバイオサイエンス" 羊土社、東京, 1-130 (1996)
• [文献書誌] 香川靖雄: "分子医化学シリーズ3「動的な反応の場としての生体」" メジカルビュー社,東京、, 1-300 (1996)