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本年度も前年度に引き続きは、高圧多次元NMR測定に向けての予備的な実験として、高圧NMR用耐圧キャピラリーの作製と、高圧下でのタンパク質の構造機能相関解明のための高圧下レーザーフラッシュフォトリシスの実験を中心に行った。従来からの高圧NMR用耐圧キャピラリーは、スピニングが可能で2次元NMR測定のための十分な分解能は得られるものの、試料管内径が1mmと小さいため、十分なS/N比を得ることが困難であった。そこで、前年度から検討しているプローブヘッドの改造によるより高いS/N比の実現とともに、増圧機からの加圧用チューブをNMRプローブヘッドまで導き、耐圧ガラスセルと接続する方式についても検討をはじめた。一方、高圧下レーザーフラッシュフォトリシスの実験では、前年度までのミオグロビンのアミノ酸置換体の配位子結合反応の他に、さらに圧力効果の応用として、ルテニウム修飾亜鉛置換ミオグロインを用いた、蛋白質内電子伝達反応の圧力依存性を検討した。部位特異的アミノ酸置換により電子伝達のドナー、アクセプター間の距離を変化させたミオグロビンを用い、電子伝達反応における活性化体積を求めたところ、正の値(4〜17cm/mol)が得られ、これは従来の電子伝達反応における負の小さな値(0〜-6cm/mol)とは大きく異なった。このことは、ルテニウム修飾亜鉛置換ミオグロビンの系では、従来、蛋白質の電子伝達反応であまり考慮されなかった熱運動による蛋白質構造の揺らぎの効果が現れていると考えられる。このような圧力による動的な構造変化を、立体構造の上でも捉えるために、来年度以降、アミノ酸置換ミオグロビンにおける詳細な構造変化を高圧多次元NMRで追跡する予定である。
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