| 研究課題/領域番号 |
07558216
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (30156195)
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| 研究分担者 |
小堀 正人 山之内製薬株式会社, 第二分子医学研究所, 主任研究員
沖花 裕行 藤本製薬株式会社, 創薬研究所, 課長(研究職)
木村 信也 大阪大学, 微生物病研究所, 教務職員 (70273703)
田中 誠司 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (50263314)
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| キーワード | cDNAライブラリー / サブトラクション / ノーザンブロット / 減数分裂 / 転写誘導 / 分裂酵母 / マウス精巣 / 遺伝子破壊 |
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| 研究概要 |
昨年に引き続き、哺乳動物と分裂酵母の系において重差分化法を適用していった。
(哺乳動物細胞)マウスの精巣では17週齢以降になって初めて精子(ハプロイド細胞)が出来始める。整体の精巣cDNAライブラリーから16週齢マウスの精巣由来mRNAをサブトラクションして精子特異的に転写誘導される一群の遺伝子を全てクローニングする目的でサブトラクティッドcDNAライブラリーを作製した。2万クローンから成る1次差分化cDNAライブラリーをランダムに選んでノーザンブロットを行い、精子特異的な転写誘導を決定したところ約30%が100倍以上の転写誘導がかかった遺伝子であった。現在までに68種類の精子特異的遺伝子を単離したが、その塩基配列を決定したところ数個の既知遺伝子が同定された以外は殆どが新規遺伝子であった。2次差分化cDNAライブラリーもうまく作製することに成功したので現在500クローンについてノーザンロット検定と塩素配列決定を行っている。
(分裂酵母)窒素枯渇条件により減数分裂を誘導する転写カスケードに載っている遺伝子(meu)の包括的クローニングを継続し、最終的に高品質の差分化cDNAライブラリーを作製することに成功した。その品質は180万クローンの独立クローンから成るcDNAライブラリーをスタートとして、1万2千クローンから成る1次差分化cDNAライブラリーを作製できた。このうちランダムに選んだ64クローンについてノーザンブロットを行い、減数分裂特異的な転写誘導を検定したところ、53クローンが転写誘導を受けていたことが分かった。これらクローンの塩基配列を決定したところ数個の既知遺伝子が同定された以外は殆どが新規遺伝子であった。現在残りのmeuについて大がかりな解析を開始している。
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