重差分化法(ESS)の開発と応用

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07558216
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (30156195)
• 研究分担者: 小堀 正人 山之内製薬(株), 第二分子医学研究所, 主任研究員 ; 沖花 裕行 藤本製薬(株), 創薬研究所, 課長 ; 木村 信也 大阪大学, 微生物病研究所, 教務職員 (70273703) ; 鍋島 建太郎 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60294120) ; 田中 誠司 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (50263314)
• キーワード: cDNAライブラリー / サブトラクション / ノーザンブロット / 減数分裂 / 転写誘導 / 分裂酵母 / 遺伝子破壊 / 癌転移

研究概要

本年度は分裂酵母の系で減数分裂を誘導する転写カスケードに載っている遺伝子(meu)をさらに多数クローニングするとともに、それらの減数分裂における機能解析を始めた。meu遺伝子の塩基配列を決定した結果、そのほとんどは新規遺伝子であり、興味深いことにそのうちの80%は出芽酵母には存在しない遺伝子であった。各々のmeu遺伝子の破壊株を作製したり過剰発現系を構築したりして調べた結果、いずれのmeu遺伝子も減数分裂に多彩な形で影響を与えることが明らかになった。しかも、いずれも減数分裂を完全には阻止しない、すなわち遺伝子欠損に由来する減数分裂不全の表現型による選択を指標にした突然変異株樹立による手法では原理的に単離できないタイプの制御遺伝子がmeu遺伝子の中に数多く含まれる、すなわち重差分化法が有用なことを示した。一方、同様な手法でマウスの精子に特異的に転写誘導される遺伝子群(TAU)を包括的に単離できる差分化cDNAライブラリーを作製した。そのために成体マウス(35日齢)の精巣由来のcDNAライブラリーを作製し単鎖化し、精子を生み出せない子供マウス(16日齢)の精巣から抽出したmRNAをビオチン化してハイブリダイズさせ、アビジンで除去して精子特異的差分化cDNAライブラリーを作製した。重差分化法を適用し、段階的に差分化を3次差分まで繰り返して構成するcDNAを解析し、これまでに77種類のTAU遺伝子を同定したが、塩基配列決定の結果やはり大半は新規遺伝子であった。他方、マウス・メラノーマ亜株B16-F10(低転移型)とB16-BL6(高転移型)との融合細胞の作製を行って、BL6が示す高転移性が優性な表現型であることを示した。両者の差分化cDNAライブラリーを作製して癌細胞に浸潤・転移能を付与する候補遺伝子(TIB)を多数単離して機能解析してきた。

研究成果

• [文献書誌] Kanaoka,Y., et al.: "GAK : a cyclin G associatde kinase contains a tensin/auxilin-like domain." FEBS Lett.402. 73-80 (1997)
• [文献書誌] Ishida,A., et al.: "Induction of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21^<Sdi/Cipl/Wafl> by nitric oxide-generating vasodilator in vascular smooth muscle cells." J.Biol.Chem.272. 10050-10057 (1997)
• [文献書誌] Kubota,Y., et al.: "Licensing of DNA replication by a multi-protein complex of MCM/P1 proteins in Xenopus eggs." EMBOJ.16. 3320-3331 (1997)
• [文献書誌] Tsuruga,H., et al.: "HsMCM6 : a new member of the human MCM/P1 family encodes a protein homologous to fission yeast Mis5." Genes to Cells. 2. 381-399 (1997)
• [文献書誌] Tsuruga,H., et al.: "Expression,nuclear localization and interactions of human MCM/P1 proteins." Biochem.Biophys.Res.Commun.236. 118-125 (1997)
• [文献書誌] Kimura,S.H., et al.: "Structure,expression,and chromosomal localization of human GAK." Genomics. 44. 179-187 (1997)
• [文献書誌] Kondoh,N., et al.: "Assignment^a of synaptonemal complex protein 1 (SCP1) to human chromosome 1p 13 by fluorescence in situ hybridization and its expression in the testis." Cytogenet.Cell Genet.78. 103-104 (1997)
• [文献書誌] Satoh,T., et al.: "Assignment of the human CDC21(MCM4)gene to chromosome 8q11.2." Genomics. 46. 525-526 (1997)
• [文献書誌] Matsui,M., et al.: "Mapping of six germ cell-specific genes to mouse chromosomes." Mamm.Genome. 8. 873-874 (1997)
• [文献書誌] Okuzaki,D., et al.: "Gin4 of S.cerevisiaeisa bud neck protein that interacts with the Cdc28 complex." Genes to Cells. 2. 753-770 (1997)
• [文献書誌] Ito,A., et al.: "Granzyme B is a transcriptional target of MITF in murine mast cells." Blood. (in press).