| 研究概要 |
1)ブタ腎Na^+,K^+-ATPaseをNa^+存在下50mM Pyridoxal 5'-diphospho-5'-adenosine (AP_2PL)で処理して得られた標品はAP_2PL probeをα鎖のLys^<480>に〜0.5/α含みNa^+に依存したATPからのEP形成能は5お%に低下した。この標品をさらにfluorescein 5'-isothiocyanateで処理するとATPからのEP形成能は5%以下に低下したがacetylphosphateからのそれはほとんど影響を受けなかった。Mg^<2+>存在下のNaE_1へ種々の濃度のATPを添加すると、AP_2PL蛍光の速やかな減少後緩慢な増加が観察されたが、FITC蛍光の変化は検出されなかった。一方KE_2へNa^+と種々の濃度のATPを添加すると同様なAP_2PL蛍光の2相性の変化が生じたがFITC蛍光の変化は単相性でextentもrateも〜mM ATPで飽和した。以上の結果はLys^<480>に結合したAP_2PL probeがNa^+, K^+-ATPaseの同時に存在する各々2種類の高親和性部位と低親和性部位へのATP結合を認識することを示唆している。α鎖当たりのEP量、AP_2PL, FITC,及びOuabain結合量からNa^+, K^+-ATPaseの機能的単位は(αβ)_2もしくは(αβ)_4と推定される。
2)新規に見い出したブタ胃H^+, K^+-ATPaseα鎖のTyr^0とTyr^7の他にSer^<27>が酵素標品中のkinasesによりリン酸化されることを証明した。またSer^<27>のリン酸化が酸分泌刺激によって上昇するとされるCa^<2+>に依存することも見い出した。Ser^<27>は内因性のSer-kinaseのみならず、外部から加えたC-キナーゼ及びA-キナーゼによってもリン酸化された。これらTyr及びSerのリン酸化は可逆的で内在するフォスファターゼで脱リン酸化された。リン酸化反応のCa^<2+>濃度依存性、C-キナーゼの活性化因子の効果及び抗C-キナーゼ抗体との反応性から、内因性のSer-キナーゼはC-キナーゼであると結論した。一方、Tyr-キナーゼをCHAPSで可溶化後、精製を試み、一次構造をcDNA側から決定することを試みている。部分精製標品の分子量はゲルろ過カラム及び活性染色の結果から、約分子量5万と推定された。Maltose binding proteinとH^+、K^+-ATPaseα鎖のGly^2からGln^<111>を含むpeptide部分からなる融合蛋白とその変異蛋白を用いた実験から、上記kinasesによるvanadate存在下でのリン酸化には細胞質に存在するH^+, K^+-ATPaseα鎖のN-terminalを含む最初のsoluble domainで充分であること、又Tyr^7のリン酸化にはTyr^<10>のリン酸化が必須であることも示された。
3)現在、H^+, K^+-ATPaseのキナーゼリン酸化の有無を種々の蛍光プローブで処理したNa^+,K^+-ATPase標品の示すイオンの閉塞を、本研究で完成したロ過装置を用いて開始したところである。
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