末端酸化酵素選択的抗菌剤の開発と気質酸化機構の生化学的解析

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07558221
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 茂木 立志 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (90219965)
• 研究分担者: 長村 俊彦 (株)ユニソク, 科学機器開発研究所, 所長 ; 三芳 秀人 京都大学, 農学部, 助教授 (20190829)
• キーワード: キノンアナログ / 抗菌剤 / 末端酸化酵素 / 基質酸化機構 / 大腸菌 / 耐性変異 / 置換フェノール類 / ユビキノン

研究概要

好気的呼吸鎖のキノール酸化酵素を標的とする特異的抗菌剤の開発と基質酸化機構の解明を目的とした研究を進め、以下の成果を得た。1)キノール酸化部位:基質認識機構を解明するため、系統的に合成したユビキノン誘導体を用いて置換基の効果を検討した。大腸菌チトクロムboとチトクロムbdは、一次構造に全く相同性が無いにも関わらず、共に2-メトキシ基と5-メチル基の認識部位に立体的な制約を持つことが判明した。チトクロムboでは、6-イソプレニル基が結合親和性に関与することを見い出した。2)キノン結合部位:置換フェノールを用いた研究から、チトクロムboの高親和性キノン結合部位(Q_H)は、キノール酸化部位(Q_L)とは異なる認識機構を持つことが判明した。また、阻害剤での再構成実験と還元型酵素と酸素との反応の解析から、Q_Hは分子内電子移動を媒介することが判明した。3)キノール酸化酵素の新規阻害剤:アンチマイシンA、ロテノン、カプサイシンなどの誘導体を合成し、アンチマイシンA誘導体の中に強い阻害活性を示すものが存在することを見い出した。4)抗菌活性と耐性変異:前年度の研究で同定した新規阻害剤の中で、3種類のキノンアナログが大腸菌の好気的増殖を抑制する抗菌剤として使用できることを確立した。更に、チトクロムboの耐性変異株を取得し、その解析を行った。本研究から、チトクロムboではサブユニットIIのQ_Lで2電子酸化が起こり、Q_HはサブユニットIの低スピンヘムに逐次的に1電子伝達を行うのみならず、リザーバーとして電子移動を調節することが示唆された。5)酵素複合体の構造:サブユニットIVの置換変異と復帰変異の解析、架橋実験から、本酵素の構造は土壌細菌のチトクロムc酸化酵素に類似することを明らかにした。また、6Åの反射を示す結晶を得、現在、構造決定のために結晶化条件を検討している。

研究成果

• [文献書誌] M.Tsbaki,T.Mogi,H.Hori,M.Sato-Watanabe,and Y.Anraku: "FT-IR and EPR studies on cyanide-bindings to the heme-copper binuclear center of cytochrome bo-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli:Release of CuB-cyano complex in the partially reduced states." J.Biol.Chem. 271. 4017-4022 (1996)
• [文献書誌] H.Hori,M.Tsubaki.T.Mogi,and Y.Anraku: "EPR and NO complex of bd-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli. The proximal ligand of heme d is a nitrogeneous amino acid residue." J.Biol.Chem. 271. 9254-9258 (1996)
• [文献書誌] K.Saiki,T.Mogi,and Y.Anraku: "Probingg a role of subunit IV of the Escherichia coli bo-type ubiquinol oxidase by deletion and cross-linking analyses." J.Biol.Chem. 271. 15336-15340 (1996)
• [文献書誌] K.Sakamoto,H.Miyoshi,K.Takegami,T.Mogi,Y.Anraku,and H.Iwamura: "Probing substrate bindings site of the Eschericia coli quinol oxidases using synthetic ubiquinol analogues based upon their electro-donating efficiency." J.Biol.Chem. 271. 29897-29902 (1996)
• [文献書誌] K.Sakamoto,H.Miyoshi,K.Matsushita,M.Nakagawa,I.Ikeda,M.Ohshima,O.Adachi,T.Akagi,and H.Iwamura: "Comparison of the structural features of ubiquinone reduction sites between glucose dehydrogenase in Escherichia coli and bovine heart mitochondrial complex I." Eur.J.Biochem.237. 128-135 (1996)
• [文献書誌] C.Lim,H.,H.Ueno,H.Miyoshi,H.Miyagawa,H.Iwamura,and T.Ueno: "Phytotoxic compounds cochlioquinones are inhibitors of mitochondrial NADH-ubiquinone reductase." J.Pesticide Science. 21. 213-215 (1996)
• [文献書誌] H.Miyoshi,M.Tamaki,H.Murata,T.Ikemoto,T.Shibuya,K.I.Harada,M.Suzuki,and H.Iwamura: "Uncoupling mechanisms of glycoside antibiotic aculeximycin in isolated rat-liver mitochondria." J.Biochem.119. 274-280 (1996)
• [文献書誌] A.Yamashita,H.Miyoshi,T.Hatano,and H.Iwamura: "Direct interaction between mitochondrial succinate-ubiquinone and ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase probed by inhibitor sensitivity." J.Biochem.120. 377-384 (1996)
• [文献書誌] T.Satoh,H.Miyoshi,K.Sakamoto and H.Iwamura: "Comparison of the inhibitory action of synthetic capsaicin analogues with various NADH-ubiquinone oxidoreductases." Biochim.Biophys.Acta. 1273. 21-30 (1996)
• [文献書誌] H.Ueno,H.Miyoshi,M.Inoue,Y.Niidome and H.Iwamura: "Structural factors of rotenone required for inhibition of various NADH-ubiquinone oxidoreductases." Biochim.Biophys.Acta. 1276. 195-202 (1996)
• [文献書誌] V.Yankovskaya,V.,S.O.Salbin,R.R.Ramsay,T.P.Singer and H.Miyoshi: "Inhibitor probes of the quinone binding sites of mammalian complex II and Escherichia coli fumarate reductase." J.Biol.Chem. 271. 21020-21024 (1996)