| 研究概要 |
アミノ基転移酵素の特異な基質特異性を解析するために,新たな方法論の開発が必要となった。そのために,昨年度に引き続いて,「相同的組換え法によるキメラ作製法」の蛋白質工学への適用範囲の検討をより詳細に行った。
「相同的組換え法によるキメラ作製法」では,環状プラスミドを制限酵素で切断して線状DNAとし,大腸菌を形質転換する。すると,適当な制限酵素部位やプライマーDNAが無くても,大腸菌内におけるDNAの相同的組換えにより,一連のキメラ遺伝子を作製することができる。このキメラ作製法を利用する際の(1)相同DNA領域の長さ依存性,(2)相同領域のDNA配列依存性,(3)プラスミドDNA全体における相同領域の位置依存性などを調べた。その結果,相同DNA領域の長さに比例してキメラ遺伝子の収率が増加し,その収率は相同領域のDNA配列にはほとんど依存しなかった。さらに,鎖状DNAの末端に近い相同領域でDNAの組換えが起こる確率が高かった。
この方法を利用して得られたアスパラギン酸アミノ基転移酵素と芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素の一連のキメラ酵素は,意外なことに,2つの親酵素と同様の安定性を保持していた。また,揺らぎが大きいキメラ酵素ほど,疎水性基質の特異性が低いことがわかった。
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