哺乳類胎仔生殖細胞の操作による遺伝子導入技術の開発研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07558290
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 国立遺伝学研究所
• 研究代表者: 中辻 憲夫 国立遺伝学研究所, 遺伝実験生物保存研究センター, 教授 (80237312)
• 研究分担者: 小倉 淳郎 国立予防衛生研究所, 獣医科学部, 主任研究官 (20194524) ; 白吉 安昭 国立遺伝学研究所, 遺伝実験生物保存研究センター, 助手 (90249946)
• キーワード: 胎仔生殖細胞 / 遺伝子導入 / 減数分裂 / 体外受精 / 精子細胞 / 顕微注入 / 細胞融合

研究概要

生殖巣へ到着後のマウス始原生殖細胞を取りだし、サイトカインLIFを培養液に加えると同時にフォルスコリンやレチノイン酸存在下で培養することによって樹立したEG細胞株について、生殖細胞の性質を保持しているかを検定するために胎仔精巣や卵巣の体細胞との再凝集塊を作成した。これらをWミュータントマウスの精巣や卵巣内へ移植して配偶子分化が起きるかを調べる実験を行ったが、いまのところテラトーマに分化しているらしく、生殖細胞の分化は見られなかった。また、生殖巣から取り出した生殖細胞への培養下での遺伝子導入を行うことによって、アポトーシスを抑制する働きのあるbcl-xLやbcl-2遺伝子の発現が培養下での生殖細胞の生存を促進する効果があることを確認した。さらに、生殖細胞の長期体外培養系を開発するために、胎仔生殖巣の体細胞からの細胞株樹立を行って、それらの性質について検討した。
一次精母細胞を用いた顕微授精の試み:現在の技術では、精細胞は、二次精母細胞(2N)まで遡って雄性配偶子として用いられることが明らかにされている(マウス)。そこで、さらに減数分裂前の一次精母細胞(4N)を用いる方法の開発を試みた。成熟中卵子と電気融合し、さらにその成熟完了卵子の活性化したところ、正常二倍体胚が得られることが分かった。精細胞の体外減数分裂の試み:減数分裂前の精細胞のみを含む生後15日令の精巣細胞を10日間培養することで、体外で減数分裂を完了させる方法を開発した。精子細胞の顕微授精を用いたDNA注入:マウスでは、精子細胞を用いて容易に産子が得られる。そこで、同時にDNAを注入することで、トランスジェニックマウスが得られるかどうか試みた。GFP遺伝子を用いたところ、4細胞期から蛍光を見られはじめ、胚盤胞まで発生した15個の胚のうち、5個が蛍光を発し、少なくとも、精子細胞と同時に卵子へ注入したDNAが前核に取り込まれたことが確認された。

研究成果

• [文献書誌] Koshimizu,U.,他: "Functional requirement of gp 130-mediated signaling for growth and survival of mouse primordial germ cells in vitro and derivation of embryonic germ (EG) cells." Development. 122. 1235-1242 (1996)
• [文献書誌] Kawase,E.,他: "A combination of buffalo rat liver cell-conditioned medium,forskolin and membrane-boundstem cell factor stimulates rapid proliferation of mouse primordial germ cells in vitro similar to that in vivo." Dev.Growth Diff.38. 315-322 (1996)
• [文献書誌] Watanabe,M.,他: "Gene transfection of mouse primordial germ cells in vitro and analysis of their survival and growth control." Exp.Cell Res.230. 76-83 (1997)
• [文献書誌] Ogura,A.,他: "In vitro fertilization and microinsemination with round spermatids for propagation of nephrotic genes in mice." Theriogenology. 45. 1141-1149 (1996)
• [文献書誌] Tenemura,K.,他: "Birth of normal young by microinsemination with frozen-thawed round spermatids collected from aged azoospermic mice." Lab.Anim.Sci.(in press). (1997)
• [文献書誌] Wakayama,T.,他: "The female pronucleus derived from the second polar body can participate in full embryonic development." J.Reprod.Fertil.(in press). (1997)