| 研究概要 |
微生物との相互作用において機能するマメ科植物フラボノイドの生合成鍵反応に関与する酵素について,遺伝子クローニングと発現による機能の確認,反応機構の検討を行った.
1.6′-Deoxychalcone synthase(DOCS)のDNAクローニング:エリシター(酵母エキスやその分画物)で刺激したカンゾウ(Glycyrrhiza echinata)培養細胞は特殊なフラボノイド・レトロカルコンを合成する.この細胞のcDNAライブラリーより,マメ科の活性フラボノイド生合成の導入酵素DOCSのコンポーネントであるchalcone synthase(CHS)とpolyketide reductase(PKR)クローンを得た.PKRは全長の塩基配列決定後,site-directed mutagenesisの手法を援用して大腸菌で過剰発現させ,西洋タンポポの粗酵素液と組み合わせて酵素活性を確認した.CHSは部分長であったので、これをプローブにして全長のクローニングを検討している.
2.O-メチル転移酵素の検索:アルファルファ根のメチル化カルコンは,共生窒素固定の植物側の化学シグナルで,根粒細菌のnodgeneを誘導する.今回このカルコンの生成に関わるchalcone methyltransferaseが,レトロカルコン生合成中間体licodioneをもメチル化することを見いだした.カンゾウ本来のlicodione methyltransferaseの活性の検討と,反応機構と生理機能の解明のためのクローニングを計画している.
3.Cytochrome P450遺伝子のクローニング:微生物との共生に関与する可能のあるlicodione synthase(LS)と,感染からの防御(phytoalexin合成)に関わるisoflavone synthaseとは,同じ基質(liquiritigenin)に対するP450monooxygenaseである.これらのクローニングを目指して,カンゾウcDNAに対してP450の共通配列に基づくPCRを行い,数種類のP450断片を得た.今後全長の取得,機能解析に進む予定である.
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