植物病原糸状菌の宿主特異的毒素生合成の分子機構

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07660055
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 柘植 尚志 名古屋大学, 農学部, 助教授 (30192644)
• キーワード: 植物病原糸状菌 / 宿主特異的毒素 / Alternaria alternata / 病原性遺伝子

研究概要

Alternaria属糸状菌には、病原性の決定因子として宿主特異的毒素を生産する7種の重要植物病原菌が存在する。本研究では、これら病原菌のうちナシ黒斑病菌(the Japanese pear pathotype of A. alternata、宿主特異的AK毒素生産菌)を用いて、その病原性(毒素生産性)遺伝子の検索を中心に、以下の研究を行った。
1.毒素生産時に特異的発現されるmRNAのサブトラクション法による検索
黒斑病菌は、静置培養時には毒素を生産するが、振とう培養時には全く生産しないことを先に確認している。そこで、静置と振とうの両条件下で培養した菌体からmRNAを抽出し、両者に共通して存在するmRNAをサブトラクション法によって除去し、毒素生産時特異的なmRNAを濃縮した。得られたmRNA画分のcDNAライブラリーを作製し、静置培養菌体と振とう培養菌体から抽出したmRNA由来のcDNAをプローブとしてディファレンシャルスクリーニングを行った。静置培養菌体由来のcDNAとのみハイブリダイズする15クローンを選抜し、それらのうち少なくとも3クローンが静置培養時にのみ発現するmRNAのcDNAであることをノーザンハイブリダイゼーションによって確認した。
2.遺伝子タギングによる病原性欠損変異株の分離
REMI(restriction enzyme-mediated integration)法を用いた遺伝子タギングにより、AK毒素欠損変異株の分離を試みた。REMI法を用いて黒斑病菌を形質転換したところ、形質転換頻度が約10倍向上し、その有効性が示された。約1000株のREMI形質転換体から、AK毒素生産性を失活した3株の病原性欠損変異株を選抜した。さらに、これら変異株の染色体DNA-におけるベクターDNAの存在様式を解析し、ベクターDNAと隣接する染色体DNAを同定・回収した。

研究成果

• [文献書誌] Shiotani,H.: "Efficient gene targeting in thefilamentous fungus Alternaria alternata" Molecular & General Genetics. 248. 142-150 (1995)
• [文献書誌] Tanabe,K.: "Characterization of the mutantsof Alternaria alternata Japanese pear pathotype deficient in melanin production and their pathogenicity" Annals of Phytopathological Society of Japan. 61. 27-33 (1995)
• [文献書誌] Kusaba,M.: "Phylogeny of Alternaria fungi known to produce host-specific toxins on the basis of variation in internal transcribed spacers of ribosomal DNA" Current Genetics. 28. 491-498 (1995)
• [文献書誌] 柘植尚志: "植物病原糸状菌の宿主特異的毒素" バイオサイエンスとインダストリー. 53. 11-15 (1995)
• [文献書誌] Kohmoto,K.: "Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases:Histopathological,Biochemical,Genetic and Molecular Basis,Vol.II Eukaryotes" Kohmoto,K.,Singh,U.S.,& Singh,R.P.,eds.,Pergamon, 407 (1995)
• [文献書誌] Tsuge,T.: "Molecular Aspects of Pathogenicity and Host Resistance:Requirement for Signal Transduction" Milles,D.& Kunoh,H.,eds.,The American Phytopathological Society Press(印刷中), (1996)