エキソ型グリコシダーゼの活性部位微細構造の解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07660087
• 研究種目: 一般研究(C)
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 松井 博和 北海道大学, 農学部, 助教授 (90109504)
• キーワード: エキソ型 / グルコシダーゼ / デキストラナーゼ / 化学修飾 / 活性部位 / イソマルトトリオース

研究概要

本研究はエキソ型加水分解酵素であるα-glucosidaseやdextranasに焦点を絞り、これらの活性部位構造を明らかにすることを目的としている。本年度は研究の進んだテンサイα-glucosidaseとBrevibacterium fuscum var.dextranlyticum由来のisomaltotrio-dextranaseについて得られた成果を報告する。
1.テンサイα-glucosidaseについて
テンサイ起源α-グルコシダーゼを親和標識試薬であるコンドュリトールBエポキサイド(CBE)を用いて修飾した。活性はCBE濃度および修飾反応の時間とともに減少し、その失活は擬一次反応に従った。拮抗阻害剤であるTrisは修飾から酵素を防御し、また部分修飾酵素のK_m値は変動せず、Vのみ減少することを明らかにした。^3H-CBEラベル酵素および非修飾酵素をプロテアーゼで限定分解し、CBE結合ペプチドおよびそれに相当する非結合ペプチドについてアミノ酸配列を調べることにより、CBEと結合するアミノ酸残基Aspを同定し、その近傍の一次配列を一DGIWIDMNE一と決定した。
2.Brevibacterium fuscum var.dextranlyticum由来のisomaltotrio-dextranaseについて
本菌体培養ろ液より、硫安分画、DEAE-Sepharose、Bio-Gel P-100、ハイドロキシアパタイトの各カラムクロマトグラフィーにより、電気泳動的に単一なisomaltotrio-dextranaseを精製した。分子量は70kDa、至適pHは7.5であった。デキストラン分解の初期産物はイソマルトトリオースのみであった。

研究成果

• [文献書誌] S.Iwanami: "Chemical Modification and Amino Acid Sequence of Active Site in Sugar Beet α-Glucosidase" Biosci.Biotech.Biochem.,. 59. 459-463 (1995)
• [文献書誌] K.Ozawa: "Purification and Properties of Acid Phosphatase secreted from Lupin Roots under Phophorus-Deficient Conditions" Soil Sci.Plant Nutr.,. 41. 461-469 (1995)
• [文献書誌] H.Ito: "Genomic Nucleotide Sequence of a Rice Peroxidase Gene," Plant Physiol.,. 108. 1747 (1995)
• [文献書誌] 高柳 勉: "イソマルトデキストラナーゼによる酸処理デキストランからのイソマルトースの新しい調整法" 応用糖質科学. 42. 381-385 (1995)
• [文献書誌] H.Mori: "Substrate Specificity and Subsite Affinities of α-Amylase from Germinating Cotyledons of Phaseolus vulgaris L.cv Toramame" Oyo Toshitsu Kagaku. 42. 387-394 (1995)
• [文献書誌] S.Iwanami: "Identification of Essential Lonizable Groups of Rice α-GlucosidaseII" Oyo Toshitsu Kagaku. 43(in press). (1996)