好塩性酵素としてのサーモライシンの構造と機能の解明および応用

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07660109
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 井上 國世 京都大学, 農学部, 教授 (10223249)
• キーワード: 好塩性酵素 / サーモライシン / 金属プロテイナーゼ / 基質特異性 / 酵素活性 / チロシン / 化学修飾 / プロテアーゼ

研究概要

1.サーモライシンの好塩性に対する静電的相互作用の関与:塩によるサーモライシン(TLN)の活性化を、pHや温度および媒質に添加したアルコール濃度を変化させて検討した。TLNの活性はベル型のpH依存性を示し、至適pHは7.0であり、活性解離基としてGlu143(pKa1=5.4)とHis231(pKa2=7.8)が関与する。NaClを0から4Mへ添加すると、pka1は5.4から6.7へ増大したが、pKa2は変化しなかった。一方、4M NaCl存在下の活性とOM NaCl存在下の活性との比を塩による「活性化度」と定義した。これは中性で最大(16倍)となるベル型であり、pHと9ではほぼ2倍の活性化度を示した。活性化度は酵素の解離基の状態に著しく依存し、全電荷数は少ないが、正負電荷が混在する中性で高い活性化度を与え、いずれかの電荷のみが多数を占める酸性やアルカリ性では活性化度は小さい。中性において、温度を5から35℃まで上昇させると、酵素活性は上昇するが活性化度は逆に20倍から4倍に減少した。アルコールを添加すると、アルコール濃度と炭素数の増大につれ活性化度は減少した。温度の上昇、アルコールの濃度と炭素数の増加に伴い溶媒の誘電率は低下し、酵素表面における静電的相互作用(反発と引力)を強化させる。高濃度の塩の存在下において溶媒のイオン強度や誘電率に支配される酵素とイオンとの相互作用がTLNの塩による活性化に影響を及ぼすと考えられる。
2.TLNのチロシン残基(Tyr)の化学修飾:TLNに存在する28残基のTyrの存在状態をpHジャンプ法とpH依存的な滴定により決定したTyrをニトロ化およびアミノ化してイオン化の度合を変化させ、塩による活性化度を調べた。ニトロ化により負電荷を導入すると活性化度は低下したが、ニトロTyrが非解離のpH域では活性化度に変化はない。これをアミノ化すると活性化度は未修飾酵素のレベルに回復した。すなわち、塩による活性化は分子表面に負電荷を導入するほど低下する。

研究成果

• [文献書誌] Y.Iba,T.Kaneko,K.Inouye,他: "A new system for the expression of recombinant antibody in mammalian cells." Biotechnology Letters. 17・2. 135-138 (1995)
• [文献書誌] K.Inouye,S.Izawa,A.Saito & B.Tonomura: "Effects of alcohols on the hydrolysis of colominic acid catalyzed by streptococcus neuraminidase" Journal of Biochemistry. 117・3. 629-634 (1995)
• [文献書誌] K.Inouye,S.B.Lee,& B.Tonomura: "Effect of amino acid residues at the cleauable site of substrates on the remarkable activation of・・・" Biochemical Journal. 315・1. 133-138 (1996)
• [文献書誌] 森本康一,井上國世: "IgMモノクローナル抗体からの活性断片F(ab′)zμの簡便な調製法" 生化学. 68・1. 42-45 (1996)
• [文献書誌] M.Kondo,T.Taya,K.Inouye,他: "Use of a surface plasmon resonance biosensor for the determination of binding constants of・・・" Biotechnology Techniques. 10・8. 547-552 (1996)
• [文献書誌] 久保幹,蓮実文彦,井上國世: "バイオマス資源の新規利用-植物タンパク質と微生物を用いた環境浄化" Bio Industry. 13・3. 44-51 (1996)
• [文献書誌] 井上國世: "モノクローナル抗体の利用の現状" 化学と生物. 34・4. 240-253 (1996)
• [文献書誌] T.Takita,Y.Ohkubo,K.Inouye 他: "Lysyl-tRNA syntherase from Bacillus stearothermophilus. Purification,and fluorometric and・・・" Journal of Biochemistry. 119・4. 680-689 (1996)
• [文献書誌] T.Taya,K.Yasukawa,K.Inouye,他: "Genetically engineered antibodies which have reduced binding affinity for thyroxine・・・" Biotechnology Letters. 18・11. 1325-1330 (1996)
• [文献書誌] S.B.Lee,K.Inouye,& B.Tonomura: "The states of tyrosyl residues in thermolysin as examined by nitration and pH・・・" Journal of Biochemistry. 121・2. 231-237 (1997)
• [文献書誌] T.Takita,S.Hashimoto,K.Inouye,他: "Lysyl-tRNA synthetase from Bacillus stearothermophilus. Formation and isolation of・・・" Journal of Biochemistry. 121・2. 244-250 (1997)
• [文献書誌] T.Takita,S.Hashimoto,K.Inouye,他: "A new filter assay in the study of lysyl-tRNA synthetase from Bacillus・・・" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. (1997)
• [文献書誌] K.Morimoto & K.Inouye: "Flow cytometric analysis of sialyl Lewis A antigen on human cancer cells・・・" Cytotechnology. (1997)
• [文献書誌] S.Ohnaka,E.Soga & K.Inouye: "Deletion of the K genes from the mouse hybridoma established with NS-1・・・" Cytotechnology. (1997)
• [文献書誌] 外村辨一郎,井上國世 他: "中等度好熱菌Bacillus stearothermophilus由来リジルtRNA合成酵素:構造と基質結合" 日本応用酵素協会会誌. 31. 9-17 (1996)