放線菌由来のキトサナーゼの構造と機能に関する研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07660124
• 研究機関: 近畿大学
• 研究代表者: 深溝 慶 近畿大学, 農学部, 助教授 (50181243)
• キーワード: キトサナーゼ / キトオリゴ糖 / 部位特異的変位導入 / 触媒部位 / 熱変性 / 定常状態速度論

研究概要

Streptomyces sp.N174から得られたキトサナーゼ遺伝子を組み込んだStreptomyces lividans TK24によってキトサナーゼを大量に発現させ、S-Sepharose Fast FlowおよびBioGel Aによるカラムクロマトグラフィによって本酵素を精製した。得られたキトサナーゼとグルコサミンオリゴ糖を反応させ、生成物のアノマー型を調べたところ、a型の生成物が得られ、本酵素は加水分解ともないアノマー型を反転させるということがわかった。グルコサミンのヘキサマーを基質として反応させてみると、生成物の濃度分布はトリマ->>ダイマー>テトラマ-の順であり、ペンタマ-からは等モル濃度のダイマーとトリマ-が、テトラマ-からがダイマーが生成された。基質の重合度が高くなるにつれて、分解の初速度は増大し、本酵素は少なくとも6個のサブサイトをもっていると思われた。
本酵素の触媒活性発現のために重要な役割をはたしているアミノ酸残基を同定するために、いくつかの酸性アミノ酸残基に部位特異的変位導入を行い、活性の変動を調べてみた。その結果、Glu22とAsp40の変異体においていちじるしい活性の低下がみられ(0.2-0.7%)、これらの二つのアミノ酸残基が触媒残基であると推定できた。また、Asp37の変異体においてもかなりの活性の低下がみられ(30-50%)、熱安定性もかなり低下した。本酵素のX線結晶構造において、Asp37はHis90と近接しており、これらの残基間での相互作用を行うことによってタンパク質構造を安定化しているものと考えられた。

研究成果

• [文献書誌] T.Fukamizo: "Binding mode of N,N,N,N-tetraacetylchitotetraitol to hen egg white lysozyme." Carbohydrate Research. 267. 135-142 (1995)
• [文献書誌] T.Fukamizo: "Hen-egg-white lysozyme modified with histamine. State of the imidazolylethyl group covalently attached to the binding site" Eur. J. Biochem.231. 56-64 (1995)
• [文献書誌] T.Fukamizo: "Comparative Biochemistry of Chitinases---Anomeric Form of the Reaction Products." Biosci. Biotech. Biochem.59. 311-313 (1995)
• [文献書誌] T.Fukamizo: "Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174." Bichem. J.311. 377-383 (1995)
• [文献書誌] T.Fukamizo: "Site-directed Mutagenesis of Evolutionary Conserved Carboxylic Amino Acids in the Chitosanase from Streptomyces sp. N174 Receals Two Residues Essential for Catalysis." J. Biol. Chem.270. 31077-31082 (1995)
• [文献書誌] T.Fukamizo: "Chitinous Component of the Cell Wall of Fusarium oxysporum, its Structure Deduced from Chitosanase Digestion." Biosci. Biotech. Biochem.60(in press). (1996)