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1、菌体の培養
エノキタケ(Flammulina Karst)No4を寒天、ポテトグルコール(PDA)培地で保存していた菌を用いた。MYG(0.5%マルトエクストラクト、0.5%イ-ストエキストラクト、2.0%グルコース)液体培地で1週間培養した菌体を用いた。
2、プロトプラストの調製
酵素溶液(1.0%ウスキザイム、0.1%キチナーゼ、1.0%ザイモソアーゼ2.0%セルラーゼ1.0%BSA)を用いて、30℃で150分振とうして分解を行った。分解液を濾過し、濾液を700×Gの遠心してプロトプラストを得た。1×10^8個/mlの収率であった。
3、パルスフィールド電気泳動
1mlの1.0%低融点アガロースに入れ、氷上で固化した。プロテナーゼKで50℃、24時間処理を行った。電気泳動はCHEFタイプを用い、スイッチングタイム、泳動電圧、泳動時間を360秒-100v-12時間、660秒-75V-48時間で全泳動時間96時間で泳動を行った。泳動後エチジュウムブロマイドで染色した。バンドは6〜7本に分離した。今後は共焦点レーザー走査顕微鏡用材料を作成し、染色体数、プローブのハイブリダイズした染色体を観察する。
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