| 研究概要 |
タリン(230kD)をタンパク質分解酵素、カルパインで処理して得られたC-端側の190kD断片にはアクチン結合能があることをすでに明らかにしたが、本研究の目的はさらに190kD断片中の詳細なアクチン結合ドメインを調べると共に、N-端側の47kD断片と細胞膜との連繋の可能性も探ることである。
そこでまず、190kD断片を酵素処理した分解産物を一次元あるいは二次元電気泳動により泳動後、それらのバンドあるいはスポットをPVDF膜に転写し、アクチンオーバーレイ法によりアクチン結合能を有するバンドあるいはスポットを確認した。それらのバンドあるいはスポットをマイクロシケンス法により、N-端側からのシーケンスを調べた。また、アクチン結合能を有しないスポットのシーケンス解析も行った。これらの結果から、タリンのN-端より529アミノ酸残基から852アミノ酸残基までの範囲にアクチン結合ドメインがあることが明らかになった。また、作製したモノクローナル抗体(No. 1, 2, 3. 4)のタリン分子の認識部位を知るためにエピトープ解析を行った。No. 4の抗体は他の3種とは異なるタリンの部位を認識し、Actin Competition法を用いたELISA法による分析結果から、アクチンとタリンの結合の阻害活性を有する新奇なモノクローナル抗体であることが明らかになった。この抗体も二次元電気泳動のアクチン結合能を有するスポットを認識した。
一方、タリンのN端側47kD断片、C端側190kD断片と、細胞膜を主に構成しているリン脂質であるホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの混合物との共沈実験では、190kD断片ではなく、47kD断片がリン脂質と相互作用することが示された。またそのとき、ホスファチジルコリンではなく、酸性のリン脂質であるホスファチジルセリンが必要であることが明らかになった。
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