スピントラップNO検出法による血液細胞熟成に伴い変化するNO生成の定量測定

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07660387
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 桑原 幹典 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (10002081)
• 研究分担者: 稲波 修 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (10193559)
• キーワード: 一酸化窒素(NO) / マクロファージ / MGD / 電子スピン共鳴法(ESR) / インターフェロンγ / リポポリサッカライド / ラクトフェリン / スピン捕捉法

研究概要

本研究では、マクロファージの成熟過程に於ける、生体防御機能に重要な役割を表す一酸化窒素(NO)の生成能力を調べる目的で、インターフェロンγ、リポポリサッカライド(LPS)、ラクトフェリンによる成熟過程によるNO合成酵素(iNOS)の誘導とその活性を評価した。方法はiNOSの誘導はwestern blotting法、NOの測定は生じたNOをMGD-Feと反応させることにより、NOを安定化させ、電子スピン共鳴法により測定した。またグリース反応も用いて定量した。チオグリコレートで誘導したマウスの腹腔マクロファージを単離し、大腸菌由来のリポポリサッカライド(LPS)とインターフェロンγ(Inf-γ)存在下で培養したところ、経時的に培養液中にNOの蓄積を示すNO_2-+NO_2-の増加が刺激後24時間まで時間依存的に増加することが示めされた。更にMGD-FeでNOを直接測定してもNO_2-+NO_2-とパラレルに増加することが示され、このMGD-Feを用いたスピン捕捉法がNOの定量に用いることが可能であることが示された。またiNOSの特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング法によりiNOSの発現そのものを調べたところ、時間依存的に蛋白質としても発現していることが明らかとなった。炎症の際に顆粒球よりラクトフェリンが産生されるが、この免疫学的意義を検索するためにLFのマクロファージからのNO生成に及ぼす影響を評価した。すると、LF単独ではNO生成には影響は無いが、InfγでのNOの生成量をLF共存下では約1.5倍にも増強することが明らかになった。また鉄を含まないアポラクトフェリンではこうした効果が無いことが見いだされた。これらの結果はLFは炎症部位でのマクロファージの成熟を促し、殺菌能を高めるNO生成能を導く作用があることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Kuwabara, M.: "Lipid peroxide levels and superoxide-scavenging abilities of sera obtained from hotbred (Thoroughbred) horses." Journal of Veterinary Medical Science. 58. 97-101 (1996)
• [文献書誌] Nagahata, H.: "Functional characteristics of enhanced Fc receptor expression of β2 integrin-deficient bovine mononuclear phagocyte." Microbiology and Immunology. 40. 389-395 (1996)
• [文献書誌] Nagahata, H.: "Adhesiveness of extra-cellular matrices and lysosomal enzyme release from normal and β2 integrin-deficients bovine neutrophils." Microbiology and Immunology. 40. 783-786 (1996)
• [文献書誌] Yamashita, T.: "The effects. of α-phenyl-tert-butyl nitrone (PBN) on copper-induced rat fulminant hepatitis with jaundice." Free Radical of Biology and Medicine. 21. 755-761 (1996)
• [文献書誌] Ohshima, H.: "Damage induced by hydroxyl radicals generated in the hydration layer of gamma-irradiated frozen aqueous solution of DNA." Jouranal of Radiation Research. 37. 199-207 (1996)
• [文献書誌] Sato, R.: "Oral administration of bovine lactorferrin for treatment of intractable stomatitis in feline immunodeficiency virus (FIV)-positive and FIV-negative cars." American Journal of Veterinary Research. 57. 1443-1446 (1996)