分泌現象におけるカルシウム結合蛋白質のネットワーク

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07670103
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 仁木 一郎 名古屋大学, 医学部, 助教授 (10262908)
• 研究分担者: 渡辺 泰男 名古屋大学, 医学部, 助手 (10273228) ; 日高 弘義 名古屋大学, 医学部, 教授 (80100171)
• キーワード: カルシウム結合蛋白 / カルシウムシグナリング / 内分泌 / インスリン / 膵B細胞 / 糖尿病 / カルモジュリン / カルサイクリン

研究概要

本研究の目的である分泌現象に関わるカルシウム結合蛋白質の持つ役割について、平成8年度の研究により次のような成果が見られた。
まず、細胞内カルシウムセンサーとして機能するカルモジュリンについては、透過性膵B細胞における検討からこのカルシウム結合蛋白質が分泌過程の上流に働く可能性が示唆された。この上流における分泌調節機構解析のため、位相差顕微鏡による顆粒運動の可視化を試み、その運動評価に成功した。この分泌顆粒の運動観察によって、カルモジュリン依存性のリン酸化がこの運動調節に関係するという直接の証拠が得られた。このミオシン軽鎖のリン酸化にはカルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素であるミオシン軽鎖リン酸化酵素およびCaMキナーゼIIが関与することを示唆する生化学的証拠を得た。すなわち、ミオシン軽鎖のリン酸化の結果として、分泌顆粒が開口放出に好適な場所に運ばれ、分泌の増幅に関与していることが明らかにされた。さらにその選択的な阻害剤を用いた生化学的実験から、共存するカルシウム濃度によってこれらのキナーゼの役割が異なり、どちらも分泌過程におけるカルシウムシグナル伝達を担う重要なメンバーであることが判明した。現在、生理的にはどのような条件下でこの調節機構が働くかを検討している。
また、我々が分泌との関連を発見したもうひとつのカルシウム結合蛋白であるカルサイクリンが分泌のインスリン分泌調節機構については、齧歯類のカルサイクリンを大腸菌に発現させ精製カルサイクリンを得、課題であったマウスカルサイクリンに対する抗体を作製した。この精製カルサイクリンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる結合蛋白の同定は、現在検討中である。一方、このカルシウム結合蛋白の役割をウエスタンブロット法および免疫組織学的手法を用いてこの蛋白が細胞質に局在することを明らかにした。しかし、カルサイクリンのカルシウムシグナリングにおける役割を知るためには生細胞での局在を知ることが必要なので、現在培養膵B細胞を用いて蛍光マーカーとしてGreen fluorescent proteinをカルサイクリンとフ-ジョンさせた蛋白の発現を試みている。

研究成果

• [文献書誌] I.Niki: "Ca^<2+> signaling and intracellular Ca^<2+> binding proteins." J.Biochem.120・4. 685-698 (1996)
• [文献書誌] M.Hisatomi: "Ca^<2+>/calmodulin and cyclic 3,5' adenosine monophosphate control movement of secretory granules through protein phosphorylation/dephosphorylation in the pancreatic β-cell." Endocrinology. 137・11. 4644-4649 (1996)
• [文献書誌] H.Yokokura: "HMN-709,a chlorobenzenesulfonamide derivative and a new,membrane-permeable calmodulin antagonist." Jpn.J.Pharmacol.72. 127-135 (1996)
• [文献書誌] K.Yasui: "90-kDa S6 kinase is insufficient or not involved in the activation of glycogen synthase induced by insulin." Eur.J.Pharmacol.306. 317-323 (1996)
• [文献書誌] Y.Watanabe: "Neuronal nitric oxide synthase specific autophosphorylation in baculovirus/Sf9 insect cell system." Biochem.Biophys.Res.Commun.219. 638-643 (1996)
• [文献書誌] N.Kabir: "Refulation of preimplantation development of mouse embryos : Effect of inhibition of myosin light-chain kinase,a Ca^<2+>/calmodulin-dependent enzyme." The Journal of Experimental Zoology. 274. 101-110 (1996)
• [文献書誌] H.Hidaka: "KN-62 : A specific Ca^<2+>/calmodulin inhibitor as a putative functional-seaching probe for intracellular signal transduction." Cardiovascular Drug Reviews. 14・1. 84-95 (1996)
• [文献書誌] T.Sudo: "Isoform-specific intracellular vesicle formation by recombinat annexin XI-A in Sf9 cells." BIochem.Biophys.Res.Commun.223・3. 709-711 (1996)
• [文献書誌] B.C.M.Potts: "^1H NMR assignments of apo calcyclin and comparative structural analysis with calbindin D_<9k> and S100β." Protein Science. 5. 2162-2174 (1996)
• [文献書誌] N.Maeda: "Increase in insulin release from rat pancreatic islets by quinolone antibiotics." British J.Pharmacol.117. 372-376 (1996)
• [文献書誌] 日高弘義: "Ca^<2+>結合蛋白の機能" Clinical Neuroscience. 14・2. 46-50 (1996)
• [文献書誌] 仁木一郎: "膵B細胞のスルフォニル尿素レセプター" Diabetes Journal(糖尿病と代謝). 24・1. 44- (1996)
• [文献書誌] 日高弘義: "シグナルトランスダクションテラピー" Therapectic Research. 17・6. 292-298 (1996)
• [文献書誌] H.Hidaka: "Molecular and cellular pharmacology of a calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM kinase II) inhibitor,KN-62,and proposal of CaM kinase phosphorylation cascades." Academic Press,San Diego,U.S.A.. in Intracellular Signal Transduction,Advances in Pharmacology Vol.36, 193-219 (1996)
• [文献書誌] H.Hidaka: "Annexin XI,a calcium-associated nuclear protein. in Annexins : Molecular Structure to Cellular Function." R.G.Landes Company,Georgetown,U.S.A., 143-160 (1996)
• [文献書誌] H.Hidaka: "Role of phosphodiesterase III in the control of blood flow." Springer-Verlag,Tokyo,Inc.,in Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiocascular Regulation., 169-181 (1996)
• [文献書誌] 仁木一郎: "スルフォニル尿素レセプター" Annual Review内分泌、代謝1996, 32-36 (1996)